半枫荷抗炎镇痛活性部位筛选及其成分分析*

田晓明 颜立红 蒋利媛 向光锋 李高飞 吴嘉 *

(1.湖南省森林植物园，湖南 长沙 410116；2.中南大学计算机学院 湖南 长沙 410083)

半枫荷(SemiliquidambarcathayensisChang)属蕈树科(Altingiaceae)半枫荷属(Semiliquidambar)，为中国特有种、国家二级保护植物[1-2]。半枫荷药用历史悠久，其根、枝、叶、树皮和花蜜均可入药，具有祛风除湿、舒筋活血等功效[3]，民间多用其治疗风湿性关节炎、类风湿关节炎、腰肌劳损、产后风瘫、半身不遂，也可用于治疗跌打损伤、扭挫伤[4]。

半枫荷资源稀少，分布零散，主要分布于江西南部、广西北部、贵州南部、广东(海南岛在内)、湖南南部等地的山区，是当地各少数民族群众常用药材[5]。因其药效物质基础尚不明确，所以一直未能得到很好的开发利用。杨武亮[6]和周光雄等[7]均证实半枫荷醇提取物具有一定的消炎止痛效果，并从乙酸乙酯萃取物中分离鉴定了齐墩果酸、3-羰基齐墩果酸、硬脂酸等9种化合物。卢海啸等[8]从半枫荷根中分离得到11个化合物，主要为三萜类化合物和鞣花酸衍生物。陈国德等[9]采用高效液相色谱法对半枫荷叶片中鞣酸、β-谷甾醇和硬脂酸含量进行测定。但有关半枫荷镇痛抗炎活性部位尚不清楚，因此本研究对半枫荷乙醇总提物及其石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水溶部位的抗炎镇痛活性进行筛选，并应用LC-MS/MS技术对活性部位化学成分进行鉴别分析，以期为该民间药材的临床应用和综合开发奠定理论基础。

1 材料

1.1试验动物 SPF级昆明种小鼠，体重18～25 g，雌雄兼有，购于福贝斯(北京)生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0010。

1.2药品与试剂 半枫荷根茎，采自湖南省靖州县，10 kg，除去泥土灰尘洗净，烘干，粉碎，75%乙醇加热回流提取3次滤过，合并滤液，减压浓缩，即得半枫荷乙醇提取浸膏。将乙醇提取浸膏存储于4 ℃冰箱中，药理试验前以1.5%吐温80配成1000，800和400 mg·kg-1剂量备用。取部分乙醇提取浸膏混悬于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取5 次，合并各个萃取液，萃取后的水层及各溶剂萃取液减压浓缩，得到石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位，正丁醇萃取部位，水溶部位。将所得的各相萃取物存储于4 ℃冰箱中，药理实验前以1.5%吐温80配成相应浓度。阿司匹林(拜耳医药保健有限公司)；醋酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；二甲苯(分析纯，杭州众化科技有限公司)；吐温80(上海信裕生物科技有限公司)；伊文思蓝(Aiaddin公司)。

1.3方法

1.3.1对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 90只小鼠，雌雄各半，随机分为9组(n=10)，空白组(1.5%，吐温80，生理盐水10 mL·kg-1)，阳性对照组(阿司匹林，100 mg·kg-1)，各个给药组动物灌胃给药1 h后，于每只动物的右耳里外两面涂布40 μL二甲苯，该动物的左耳作为自身对照。4 h之后，脱臼处死动物，迅速剪下动物对称的双耳，用打孔器(直径9 mm)分别在左右相同部位取下圆耳片，称质量，记录质量，同一只动物左右耳的重量差即为肿胀度。耳肿胀抑制率=(空白组肿胀度-药物组肿胀度)/空白组肿胀度×100%。

1.3.2对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 分组及给药方法同1.3.1。各组于给药 1 h 后，尾静脉注射0.5% 伊文斯兰(0.01 mL·g-1)，同时腹腔注射0.8% 醋酸0.2 mL·只-1，2 h后处死小鼠，腹腔注射 6 mL 生理盐水，抽取腹腔液于4 ℃放置 6 h，取其上清液，用紫外可见分光光度计(590 nm)测定吸光度(A)值，计算抑制率。抑制率=(空白组A值-给药组A值)/空白组A值×100%。

1.3.3对醋酸致小鼠扭体的影响 分组及给药方法同1.3.1。各组于给药1 h后腹腔注射体积分数0.8%的醋酸0.2 mL·只-1，观察记录注射醋酸后5～20 min内小鼠产生扭体反应(扭体反应：小鼠腹部内凹，后肢伸展，臀部抬起)的次数。计算药物对疼痛反应的抑制率。镇痛率=(空白组扭体平均数-药物组扭体平均数)/空白组扭体平均数×100%。

1.3.4对热板致小鼠疼痛的影响 分组及给药方法同1.3.1。将雌性小鼠置于恒温热板上(55±0.5 ℃)，以小鼠舔后足潜伏期为痛阈值指标。试验前筛选痛阈值为15～25 s的小鼠为合格鼠，为避免损伤小鼠足底组织，最长反应时间为60 s。于给药15、30、60 min测定小鼠痛阈值。镇痛率=(空白组痛阈值-给药后痛阈值)/空白组痛阈值×100%。

1.4活性部位成分LC-MS/MS初步分析

1.4.1色谱条件 采用LC-MS/MS(美国Thermo公司)分离活性部位中的化学成分，样品过 0.22 μm有机微孔薄膜后上样分析。液相条件为:Shim-pack GIST C18柱(2.1×75 mm，2 μm)(Shimadzu，东京，日本))；洗脱溶剂为0.1%甲酸(洗脱剂A)和甲醇(洗脱剂B)；流速0.2 mL·min-1；柱温 25 ℃；进样量 5 μL；洗脱梯度为：0 min，10%B；5 min，20%B；10 min，40%B；13 min，80%B；17 min，5%B。

1.4.2质谱条件 采用正、负离子2种模式扫描测定，电喷雾ESI离子源。质谱条件为：离子范围m/z 100～1500；碰撞气为氦气；辅助气体和屏蔽气体为氮气；喷雾电压-4.5 kV；离子源温度550.0 ℃；辅助气和喷雾气压50.0 psi；气帘气压35.0 psi；裂解电压-80 V。

2 结果

2.1半枫荷不同部位提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响 由表1可知，与空白对照组相比，乙醇提取浸膏不同剂量组、乙酸乙酯部位组对小鼠耳肿胀有明显的抑制作用；而石油醚部位、正丁醇萃位、水溶部位对小鼠耳肿胀的抑制作用与空白对照组相比差异不显著。

表1 对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

2.2半枫荷不同提取部位对醋酸致小鼠毛细血管通透性的影响 表2表明，半枫荷乙醇提取浸膏各剂量组能抑制醋酸所致的小鼠腹腔通透性增高，且随着剂量的增加，抑制作用显著加强；不同萃取部位均能不同程度降低小鼠腹腔毛细血管通透性作用，其中乙酸乙酯部位活性较强，抑制率分别为41.37%。

表2 对醋酸致小鼠毛细血管通透性的影响

2.3半枫荷不同提取部位对醋酸致小鼠扭体的影响 从表3中可以发现，与空白对照组比较，乙醇提取浸膏中剂量组和高剂量组、石油醚部位组、乙酸乙酯部位组、水溶部位组均能显著延长小鼠扭体潜伏期，但石油醚部位组、乙酸乙酯部位组和水溶部位组组间差异不显著；半枫荷乙醇提取浸膏低剂量组和正丁醇部位组对于减少小鼠20 min 扭体次数作用均不明显，与空白对照组差异不显著。

表3 对醋酸致小鼠扭体反应的影响

2.4半枫荷各部位对热板致小鼠疼痛作用的影响 从表4中可见，与空白对照组相比，乙醇提取浸膏中剂量组和高剂量组以及乙酸乙酯部位组均能提高给药15 min时热板致小鼠痛阈值，其余各组空白对照组相比差异不显著；各提取部位组别均能提高给药30 min时热板致小鼠痛阈值，且组间差异也具有统计学意义；乙醇提取浸膏低剂量组和中剂量组、石油醚部位组和正丁醇部位组对提高给药60 min时痛阈值不显著，而乙醇提取浸膏高剂量组、乙酸乙酯部位组和水溶部位组均能显著延长给药60 min热板法所致小鼠的痛阈值。总体来说，乙醇提取浸膏高剂量组和乙酸乙酯部位组在整个60 min内均表现出显著的镇痛作用，且在同等剂量下(800 mg·kg-1)，乙酸乙酯部位组镇痛作用优于乙醇提取浸膏。

表4 对热刺激致小鼠疼痛反应时间的影响

2.5半枫荷乙醇提取物乙酸乙酯部位化学成分分析 对半枫荷乙醇提取物乙酸乙酯部位LC-MS/MS分析的结果如表5和表6所示。各色谱峰相应的质谱图经人工解析及中药化学数据库(TCM)、未知物鉴定的新型数据库(mzCloud)和化学结构与文献数据库(ChemSpider)谱库检索定性，快速鉴别分析出44种化合物。半枫荷乙醇提取物乙酸乙酯部位有黄酮类成分7个，三萜类成分8个，环烯谜萜类成分2个，单萜类成分4个，酚类成分8个，其余为：氨基酸、苯丙素类、木脂素类、碳水化合物、香豆素类、异黄酮类、有机酸类成分共计15个。

表5 半枫荷乙醇提取物乙酸乙酯部位化学成分的LC-MS/MS鉴定结果(ESI+)

续表5 半枫荷乙醇提取物乙酸乙酯部位化学成分的LC-MS/MS鉴定结果(ESI+)

表6 半枫荷乙醇提取物乙酸乙酯部位化学成分的LC-MS/MS鉴定结果(ESI-)

3 讨论

炎症反应是机体最基本的抗损伤反应，也是感染等多种疾病最基本的病理过程[10]。早期炎症反应主要病理过程为：产生组织胺，羟色胺，缓激肤和前列腺素等炎症介质，促进血管舒张，增加血管通透性，进而导致毛细血管扩张和通透性亢进、渗出、水肿[11]。醋酸致小鼠毛细血管通透性增加试验，以炎症早期渗出为主作为依据，是药物对于炎症早期的抗炎作用测定常用模型之一[12]。二甲苯致小鼠耳肿胀法是急性炎性模型，利用二甲苯引小鼠机体内一些炎症介质释放[13]，继而引起毛细血管通透性增加及炎性细胞的浸润，造成耳部急性炎性水肿[14]。抗炎模型试验结果表明半枫荷乙醇提取浸膏不同剂量组和乙酸乙酯部位组能明显减轻二甲苯所致小鼠耳肿胀，明显抑制醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加，显示良好的抗炎作用。半枫荷可能是通过影响炎症介质产生抗炎作用的。

疼痛既是人体的一种反应，也是多种疾病的主要症状，镇痛药物的研究一直是影响人类健康的热点问题[15]。醋酸扭体法是用来筛选镇痛药物最常用的动物模型[16]。尽管醋酸扭体模型是非特异性痛觉模型[17]，但是目前的试验结果仍然显示半枫荷乙醇提取浸膏高剂量组和乙酸乙酯部位组灌胃给药能明显减少小鼠扭体次数，其作用可能是通过外周抗炎达到镇痛效果。为了考察半枫荷各提取物对中枢神经系统的镇痛作用，我们继而采用热板法(高位中枢镇痛)来评价半枫荷的镇痛作用。试验结果显示半枫荷乙醇提取浸膏高剂量组和乙酸乙酯部位组灌胃给药能明显延长热板法所致小鼠的痛阈值，具有一定的中枢镇痛活性。半枫荷乙醇提取浸膏和乙酸乙酯部位组在醋酸扭体法的镇痛效果远远不如热板法中的镇痛效果，说明其镇痛作用可能主要为中枢镇痛。

乙酸乙酯部位组800 mg·kg-1剂量时，在二甲苯致小鼠耳肿胀、醋酸致小鼠毛细血管通透性影响、醋酸致小鼠扭体和热板致小鼠疼痛试验中与乙醇提取浸膏800 mg·kg-1剂量组和其他萃取组相比表现出更强的抗炎镇痛作用，因而对乙酸乙酯部位组化学成分采用LC-MS/MS技术进行了快速的鉴别分析。共鉴定出44种化合物，主要为黄酮类、三萜类、环烯谜萜类、单萜类、酚类、氨基酸、苯丙素类、木脂素类、碳水化合物、香豆素类、异黄酮类、有机酸等物质。本研究为今后半枫荷有效成分单体分离鉴定和开发利用提供了一定的科学依据。