羟基红花黄色素A治疗心脑血管疾病作用机制的网络药理学研究*

乐世俊 白雪 黄昱曦 王文晓 高欢 唐于平

(陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

随着社会老龄化和竞争的加剧，心脑血管疾病为主的慢性病已成为影响我国居民健康的主要负担。环境污染和不健康生活方式如锻炼缺乏、烟草和酒精滥用等因素更加速了心脑血管疾病的流行。当前，心脑血管疾病对我国人民身体健康构成的危害已列慢性非感染性疾病的第一位，成为我国公共卫生领域亟待解决的问题[1]。现有临床证据表明，与西医治疗相比，中医药在心脑血管疾病的治疗中具有独特的优势和不可取代的地位，其中活血化瘀类中药尤为重要[2]。

红花是菊科草本植物红花(CarthamustinctoriusL.)的干燥花，作为传统活血化瘀中药已有2500多年的应用历史，始载于《开宝本草》，现为中医临床治疗心脑血管疾病常用中药之一。红花在中药方剂中以汤剂煎服为主，其水溶性成分是发挥药理效应的物质基础[3-4]。红花水提物制成的红花注射液收载于卫生部药品标准中药成方制剂二十册中，临床上广泛用于心脑血管疾病的治疗[5]。迄今，已从红花中分离鉴定200余种化合物，主要包括醌式查尔酮碳苷类、黄酮类、生物碱类、亚精胺类、甾体类及有机酸类等[6]。其中，MESELHY等[7]在1993年首次分离到的羟基红花黄色素A(HSYA)属于醌式查尔酮碳苷类化合物，是红花发挥活血化瘀功效最主要的有效单体成分，《中国药典》明确规定以该成分为指标进行红花药材质量控制。现代临床研究证实，HSYA在防治脑卒中[8]、血管性痴呆[9]等心脑血管疾病有确切疗效，但其作用机制尚未系统阐明。

网络药理学融合系统生物学、多向药理学、计算生物学、网络分析等多学科的技术和内容，进行多层次网络的构建，从整体的角度去探索药物与疾病间的关联性，指导新药研发和临床精准用药[10-12]。因此，通过查阅近10年HSYA治疗心脑血管疾病的临床前实验研究，搜集其治疗心脑血管疾病的潜在作用靶点，再运用网络药理学方法从系统层面预测HSYA治疗心脑血管疾病的作用机制。

1 材料与方法

1.1数据库与软件 通用蛋白质数据库UniProt(http://www.uniprot.org/)；生物学信息注释数据库DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov)；京都基因和基因组百科全书数据库KEGG(https://www.kegg.jp/)；网络拓扑分析与编辑软件Cytoscape 3.8.0(http://cytoscapeweb.cytoscape.org/)。

1.2HSYA作用靶点的搜集 通过对“谷歌学术”“中国知网”进行大量文献挖掘，本课题组已搜集了HSYA治疗心脑血管疾病(包括心肌缺血、高血压、动脉粥样硬化、脑缺血、血管痴呆等)的潜在作用靶点[13]。由于靶点信息来源于不同物种，将搜集到的靶点录入UniProt数据库中检索，限定物种为“Homo sapiens”，剔除重复、非人源和不规范的靶点，经检索和转化操作最终得到与HSYA相关的靶点信息。

1.3靶点GO富集和KEGG通路分析 将HSYA的潜在作用靶点信息以Gene Symbol格式导入DAVID数据库中，选择Gene Ontology(GO)项下生物过程(biological process)、细胞组分(cellular component)和分子功能(molecular function)3个模块进行GO富集分析，然后选择Pathway项下KEGG pathway进行分析，设定阈值P<0.01。选取心血管疾病和脑血管疾病的前10条生物过程(biological process)绘制条形图，选取心脑血管疾病的前20条信号通路绘制气泡图。

1.4HSYA“靶点-信号通路”网络构建和拓扑分析 将HSYA的潜在作用靶点和相关信号通路信息导入Cytoscape 3.8.0，构建“靶点-信号通路”网络。网络图中的节点为靶点和信号通路，靶点与相应通路之间有相互作用关系的以边相连。运用Network Analyzer插件对此网络进行拓扑性质分析，探究HSYA对心脑血管疾病的潜在作用机制。

2 结果

2.1HSYA作用靶点的搜集 前期通过挖掘近10年关于HSYA治疗心脑血管疾病的临床前实验研究数据，搜集到HSYA的潜在作用靶点。运用UniProt检索功能对靶点进行筛选，最终获取HSYA作用于心血管疾病和脑血管疾病的潜在靶点分别为68和54个，且共同作用靶点为28个，见图1。这些共同作用靶点如VEGFA、HIF1A、TNF、NFKB1、RELA等主要参与HSYA对动脉粥样硬化、脑缺血和心肌缺血等疾病的治疗作用。

图1 HSYA作用于心血管和脑血管的潜在靶点分析

2.2HSYA作用靶点的GO富集和KEGG通路分析 将HSYA作用于心血管疾病和脑血管疾病的潜在靶点分别进行GO富集分析，结果如图2和3所示。在生物过程、细胞组分和分子功能3个模块中，HSYA作用于心血管疾病和脑血管疾病潜在靶点的富集结果十分相似，表明两者存在相互关联的病理机制。具体而言，HSYA可能主要在胞质、胞浆和PI3K复合体中通过蛋白结合、激酶活性和超氧化物歧化酶活性调节脂多糖介导的信号转导途径(LPS-mediated signaling pathway)、一氧化氮生物合成过程(NO biosynthetic process)、NF-κB转录因子活性(NF-κB transcription factor activity)和炎症反应(inflammatory response)，从而发挥抗氧化和抗炎等药理作用治疗心脑血管疾病。另外，细胞对缺氧的反应(cellular response to hypoxia)和巨自噬(macroautophagy)等生物过程与脑血管病的发病密切相关，而HSYA可以调控这些生物过程。

图2 HSYA作用于心血管疾病潜在靶点的GO富集结果(前10条)

图3 HSYA作用于脑血管疾病潜在靶点的GO富集结果(前10条)

通过KEGG通路注释分析探讨HSYA防治心脑血管疾病潜在靶点的通路分布。结果如图4所示，HSYA可通过作用于多个靶点调控脂肪细胞因子信号通路(adipocytokine signaling pathway)、流体切应力与动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、Apelin信号通路(Apelin signaling pathway)、鞘磷脂信号通路(sphingolipid signaling pathway)、松弛素信号通路(relaxin signaling pathway)、NOD样受体信号通路(NOD-like receptor signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)和Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)等复杂信号网络，发挥抗心脑血管疾病的作用。

图4 HSYA作用于心脑血管疾病潜在靶点的KEGG通路分析(前20条)

2.3HSYA的“靶点-信号通路”网络构建和拓扑分析 如图5所示，HSYA的“靶点-信号通路”网络包含了96个节点(76个靶点和20条信号通路)和453条边，呈现出了多靶点、多通路的作用特点。根据度值排名前10位的靶点及信号通路见表1，其中NFKB1和RELA是HSYA治疗心脑血管疾病的重要靶点，流体切应力与动脉粥样硬化、TNF信号通路、脂肪细胞因子信号通路和Apelin信号通路是HSYA治疗心脑血管疾病的重要信号通路。

表1 HSYA治疗心脑血管疾病的TOP 10潜在靶点和信号通路

图5 HSYA治疗心脑血管疾病的靶点-信号通路网络图

3 讨论

目前，西医治疗心脑血管疾病以化学药物如抗血小板药物阿司匹林、他汀类药物阿托伐他汀等和介入手术治疗为主，但长期服药易发生不同程度的耐药和副作用，而手术治疗经济负担重、禁忌症多，且仍不能有效降低远期终点事件。活血化瘀类中药治疗心脑血管疾病疗效确切，有着广阔的应用前景[14]。HSYA为活血化瘀中药红花的主要有效成分，其注射剂已在临床上广泛用于治疗心脑血管疾病[8-9,15]，但其作用机制尚未系统阐明。

本研究搜集得到94个文献来源的HSYA治疗心脑血管疾病潜在作用靶点，在分别对心血管疾病和脑血管疾病的潜在靶点进行GO富集分析过程中，发现两者的富集结果十分相似，提示HSYA治疗心脑血管疾病可能存在共同的抗氧化和抗炎药理作用机制。在KEGG通路注释分析过程中，发现大部分信号通路均与心脑血管疾病的发生发展密切相关。其中，HIF-1信号通路已被蛋白质组学研究证实是HSYA发挥抗脑缺血再灌注损伤作用的重要通路[16]。本研究进一步运用网络药理学方法构建了HSYA治疗心脑血管疾病的“靶点-信号通路”网络，揭示了其具有多靶点、多通路的作用特点。网络拓扑分析结果结合临床研究证据提示，HSYA对动脉粥样硬化及其引发的脑卒中和心肌梗死具有较好的治疗潜力和疗效，但仍需开展更多基础实验和临床试验研究。

值得关注的是，HSYA可能通过调节胰岛素抵抗(insulin resistance)、胰岛素信号转导通路(insulin signaling pathway)、非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease)和长寿调节通路(longevity regulating pathway)等对心血管代谢性疾病具有潜在治疗作用。近期研究相继报道了HSYA在心血管代谢性疾病(如肥胖和糖尿病)中的治疗作用[17-18]。同时，本课题组也已证实HSYA的减肥和改善胰岛素抵抗的作用，并且肠道菌群是其潜在的“靶点”[19]。此外，与癌症相关的信号通路也表明HSYA具有一定的抗肿瘤潜力。有研究报道HSYA可以抑制肿瘤毛细血管的生成发挥抗肿瘤作用[20]。

综上所述，本研究通过网络药理学技术，分析了HSYA在治疗心脑血管疾病中的潜在靶点和信号通路，为进一步的分子机制研究提供了理论依据，也为活血化瘀类中药在治疗心脑血管疾病方面提供了机制研究的思路。但是本研究仅基于网络药理学层面对HSYA治疗心脑血管疾病的潜在作用机制进行了预测，且HSYA可能通过调节肠道菌群等多种途径对心脑血管疾病起到直接或间接调控作用，因此运用虚拟分子对接、分子生物学和多组学技术结合体内外药效学实验验证网络药理学预测的HSYA潜在作用的有价值的靶点和信号通路或将成为下一步研究的重要内容。