山楂原花青素和VC联合通过Wnt/β-catenin通路减轻胰岛素抵抗大鼠肝脏氧化应激

李西栋，孙绍霞，梁亚楠，石塔拉，宓 伟,*

（1.临沂市人民医院心血管内科，山东 临沂 276000；2.滨州医学院公共卫生与管理学院，山东 烟台 264003）

胰岛素抵抗是由胰岛素的受体数量下降、分子结构功能异常和拮抗激素分泌过多等因素引起的胰岛素靶器官对内源性或外源性胰岛素的敏感性和反应性降低[1]。胰岛素抵抗使机体对葡萄糖的摄取和利用率降低，长时间持续会使调节血糖水平的肝脏受损，所以肝脏氧化应激在胰岛素抵抗的发展进程中起着非常重要的作用[2-4]。

山楂原花青素（hawthorn proanthocyanidin，HPC）主要来源于山楂，是低聚体形式的原花青素，研究结果显示其抗氧化能力远高于来源于葡萄籽和松树皮的高聚体原花青素[5-6]。另外，大多数研究认为原花青素是改进胰岛素敏感性的有效物质，但机制尚未阐明。原花青素增加胰岛素敏感性机制的研究主要集中在胰岛素信号传导通路上关键分子的表达及活性改变方面，然而结论却并不一致，且主要以高聚体的葡萄籽原花青素为主，而氧化活性强的HPC鲜见研究。VC在蔬菜和水果中含量十分丰富，具有很强抗氧化能力，同时还能保护其他物质免受氧化破坏[7]。Wnt/β-catenin信号通路可由Wingless/integrated protein 1（Wnt1）、Wnt2、Wnt3α和Wnt8等蛋白激活，与细胞表面Frizzled家族跨膜受体蛋白Dsh结合后，Dsh被激活并抑制下游轴蛋白/糖原合酶激酶-3β/腺瘤样息肉病蛋白（Axin/glycogen synthasc kinase-3β/adenomatous polyposis coli protein，Axin/GSK-3β/APC）复合物，Axin/GSK-3β/APC复合体可抑制细胞内信号分子β-catenin的降解，使得胞浆内的β-catenin大量积聚，部分β-catenin进入细胞核与T-Cell factor/Lymphoid Enhance Factor转录因子家族如原癌蛋白（C-myc）、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators-activated receptors γ，PPARγ）、生存素（survivin）、Axin2和白细胞分化抗原44（cluster of differentiation 44，CD44）等作用并促进其表达，而PPARγ的表达与胰岛素抵抗的发展密切相关[8-10]。HPC联合VC之间抗氧化有无协同作用且通过Wnt/β-catenin信号通路减轻胰岛素抵抗氧化应激鲜见相关报道。本实验采用喂养大鼠高脂饲料制造胰岛素抵抗模型，并探讨HPC和VC联合作用通过Wnt/β-catenin分子信号通路调控PPARγ表达对大鼠胰岛素抵抗以及胰岛素的敏感性和反应性的影响，为功能食品开发和研制胰岛素抵抗肝脏氧化应激治疗新药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

雄性Wistar大鼠90 只，7～8 周龄，体质量（189±12）g，SPF级，由滨州医学院实验动物中心提供（生产许可证：SCXK（鲁）2017-0012）。在无特定病原体的条件下常规喂养大鼠，适应性喂养1 周后用于实验。

One-Touch全自动血糖仪及配套血糖试纸美国强生公司；胰岛素酶联免疫吸附测定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒美国Millipore公司；血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）试剂盒 南京建成科技有限公司；HPC（纯度95%） 中国西安绿天生物技术有限公司；VC、二甲双胍 中美上海施贵宝制药有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒 武汉优尔生科技股份有限公司；兔抗鼠Wnt1、Axin、GSK-3β、APC、β-catenin、PPARγ抗体美国Sigma公司；β-actin多克隆抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体 武汉三鹰生物公司；总RNA提取试剂盒、SYBR green试剂盒 日本Takara公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

722型分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；TDL-40B台式离心机 上海安亭科学仪器厂；凝交成像分析系统 美国Alpha Innotech公司；荧光实时定量聚合酶链式反应仪 澳大利亚Corbett公司；荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）分析仪 上海格罗贝尔生物科技有限公司；Varioskan LUX多功能酶标仪 美国赛默飞世尔科技有限公司；激光共聚焦显微镜 德国卡尔蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 胰岛素抵抗大鼠造模

将90 只雄性Wistar大鼠采用随机数字表法分为对照组10 只和高脂膳食组80 只。对照组给予配比为玉米73.5%（质量分数，后同）、麦麸20%、鱼粉5%、骨粉1%、食盐0.5%的普通饲料，脂肪供能占61%；高脂膳食组给予配比为普通饲料78.8%、胆固醇1%、牛胆盐0.2%、蛋黄粉10%、猪油10%的高脂饲料，脂肪供能占87%。两组大鼠同时喂养6 周，分别称量造模前后正常对照组和造模成功的高脂膳食组大鼠体质量，计算2 组大鼠在造模前后的体质量变化。造模成功后，对大鼠禁食12 h，次日上午将所有大鼠全麻，断尾取血1 mL，采用One-Touch全自动血糖仪检测大鼠空腹血糖浓度。同时对所有大鼠进行眼眶静脉取血，4 ℃、20 000 r/min离心20 min取上清液，参考ELISA试剂盒检测血清胰岛素浓度，参照试剂盒说明书用比色法检测血清ALT、AST和ALP活力。大鼠空腹血糖浓度不低于6.5 mmol/L且血清胰岛素浓度不低于35 μIU/mL为造模成功。

1.3.2 大鼠肝匀浆相关指标水平检测

将造模成功的胰岛素抵抗大鼠随机分为模型组、HPC组、VC组、HPC+VC组和二甲双胍组，每组10 只。对各组大鼠进行5 mL等体积灌胃：正常对照组和模型组（等体积生理盐水）、HPC（56 µg/mL）组、VC（180 µg/mL）组、HPC（56 µg/mL）+VC（180 µg/mL）组和二甲双胍（2 µg/mL）组[11]，每日1 次，连续给药12 周后，禁食12 h后，眼眶静脉取血检测葡萄糖和胰岛素水平，然后将大鼠脱臼处死，解剖后迅速出取肝脏，用生理盐水冲洗并用滤纸吸干，称取250 mg肝脏并剪成小块，置于玻璃匀浆管内，加入2.25 mL预冷的pH 7.4、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液，制备质量分数10%的肝匀浆备用，按照各试剂盒说明书分别测定各组大鼠肝匀浆中的SOD、CAT、GPx、GSH、MDA水平。

1.3.3 实时聚合酶链式反应检测Wnt1、Axin、GSK-3β、APC、β-catenin、PPARγ的mRNA表达水平

将预处理的大鼠肝细胞以0.5×106个/孔的密度接种于6 孔板。按照TRIzol法提取细胞总RNA，然后通过反转录试剂盒将mRNA反转成cDNA，采用SYBR green试剂盒进行荧光定量检测。通过ΔΔCt方法计算相对mRNA表达水平，并选择GAPDH作为内参基因[12]，通过熔解曲线分析产物的特异性。引物序列参见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.4 蛋白质印迹法检测肝组织Wnt1、β-catenin和PPARγ蛋白的表达水平

取肝匀浆200 mg，加入少量0.01 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲盐溶液清洗2 次，4 ℃、20 000 r/min离心弃去上清液，沥干后加入1 mL裂解缓冲液，冰上静置40 min，收集裂解液，4 ℃、20 000 r/min离心20 min，取上清液至EP管备用。取20 mg蛋白样品，加入6%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）上样缓冲液，沸水变性5 min，SDS-聚丙烯酰胺凝交电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后湿移至聚偏二氟乙烯膜上；用5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h，依次加入兔抗鼠Wnt1、Axin、GSK-3β、APC、β-catenin、PPARγ抗体和相应β-actin多克隆抗体，4 ℃过夜，加入0.05 mol/L pH 7.8的Tris缓冲溶液洗膜后，滴加ECL发光试剂进行检测，曝光20 s～5 min，显影2 min，定影5 min，采用Quantity One软件扫描各条带，获取目的蛋白灰度值，实验重复6 次。

1.3.5 荧光共振能量转移分析法检测Wnt1和Dsh结合情况

采用FRET分析仪检测Wnt家族分泌蛋白Wnt1和Frizzled家族跨膜受体蛋白Dsh之间是否能形成异源二聚体，分别制备对照组、模型组、HPC组、VC组、HPC+VC组和二甲双胍组处理12 周后的大鼠肝细胞的DNA和蛋白质，采用分子克隆方法构建用于FRET的两个真核重组质粒：pCFP-hWnt1-pcDNA3.1和pYFP-hDSH-pcDNA3.1。质粒构建成功后，利用pCFP-hWnt1-pcDNA3.1和pYFP-hDSH-pcDNA3.1分别转染上述制备的6 组肝细胞，转染后24 h，检测FRET信号。

1.4 数据处理与分析

实验数据用平均值±标准差表示，采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 胰岛素抵抗大鼠造模结果

80 只大鼠给予高脂膳食喂养，有54 只造模成功，成功率67.5%。如表2所示，造模后，模型组大鼠的空腹血糖、血清胰岛素、ALT、AST和ALP水平均显著高于对照组大鼠（P＜0.01）。

表2 造模后对照组和模型组大鼠各检测指标比较Table 2 Comparison of all tested parameters between control and model groups

2.2 大鼠肝匀浆中各指标检测结果

如表3所示，与对照组相比，模型组大鼠SOD、CAT、GPx、GSH水平均极显著下降（P＜0.01），而MDA含量极显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，HPC组、HPC+VC组和二甲双胍组大鼠肝匀浆中各指标含量均有极显著差异（P＜0.01）。HPC+VC组对肝匀浆中各指标干预效果优于HPC组（P＜0.05）。

表3 大鼠肝匀浆中各指标检测结果（n＝10）Table 3 Parameters in rat liver homogenate (n = 10)

2.3 HPC和VC联合对Wnt1、Axin、GSK-3β、APC、β-catenin和PPARγ mRNA表达的影响

如图1所示，与对照组比较，模型组大鼠肝组织中Wnt1和β-catenin的mRNA相对表达水平极显著增加（P＜0.01），分别增加102.34%和110.62%；Axin、GSK-3β、APC和PPARγ的mRNA相对表达水平极显著降低（P＜0.01），分别降低56.12%、60.34%、53.41%和70.05%。与模型组比较，HPC+VC组Wnt1和β-catenin的mRNA相对表达水平极显著降低（P＜0.01），分别降低了35.61%和45.21%；Axin、GSK-3β、APC和PPARγ的mRNA相对表达水平极显著升高（P＜0.01），分别升高了51.37%、69.54%、42.39%和61.54%。

图1 Wnt1、Axin、GSK-3β、APC、β-catenin和PPARγ的mRNA相对表达水平（n＝6）Fig.1 mRNA expression of wnt1, Axin, GSK-3β, APC, β-catenin and PPARγ (n = 6)

2.4 HPC和VC联合对肝组织Wnt1、β-catenin和PPARγ蛋白表达的影响

如图2所示，与对照组比较，模型组大鼠肝组织中Wnt1和β-catenin的蛋白相对表达水平极显著升高（P＜0.01），蛋白相对表达水平分别升高了56.31%和68.15%；PPARγ的蛋白相对表达水平极显著降低（P＜0.01），蛋白相对表达水平降低了82.61%。与模型组比较，HPC+VC组Wnt1和β-catenin的蛋白相对表达水平极显著降低（P＜0.01），分别降低了38.25%和47.64%；PPARγ的蛋白相对表达水平极显著升高（P＜0.01），升高了76.28%。

图2 Wnt1、β-catenin和PPARγ蛋白的相对表达水平（n＝6）Fig.2 Relative protein expression levels of Wnt1, β-catenin and PPARγ (n = 6)

2.5 FRET检测配体Wnt1和受体Dsh结合状况

转染24 h用FRET分析仪检测，激光共聚焦显微镜观察结果如图3所示。为获得FRET图像，通过受体组获得摩尔吸光系数为0.60，通过配体组获得摩尔吸光系数为0.53，配体Wnt1表达数量多呈现黑紫色，数量少呈红色，受体Dsh呈蓝紫色，配体Wnt1和受体Dsh结合形成数量少显示绿色，形成数量多会出现红黄色。与模型组相比，HPC+VC组的FRET信号明显减弱，说明随着时间的延长，Wnt1与Dsh之间的结合力明显减弱，形成的异源二聚体数量明显减少。

图3 24 h后FRET信号结果（60×）Fig.3 FRET signals acquired after 24 h (60 ×)

3 讨 论

肥胖是导致胰岛素抵抗的主要原因之一，亦会损害肝脏使其氧化应激能力降低，加剧2型糖尿病的发生和发展[13-15]。血清中ALT、AST和ALP升高可能与肝细胞的损伤有关[16]，本研究中，造模成功的胰岛素抵抗大鼠血清ALT、AST和ALP水平均高于对照组大鼠（P＜0.01）。研究证明，发生胰岛素抵抗时，肝细胞氧化应激能力增强，氧化应激与肝细胞损伤有密切联系[17-18]。肥胖导致肝脏过氧化，过氧化产生的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）和活性氮簇（reactive nitrogen species，RNS）增多，ROS和RNS氧化和损伤机体细胞内的基因，还可以激活细胞内Wnt/β-catenin通路，该分子信号通路与胰岛素抵抗和肝细胞功能受损密切相关[19-21]。本实验中，通过HPC和VC联合应用干预胰岛素抵抗大鼠，肝匀浆中SOD、CAT、GPx活力和GSH含量均显著升高而MDA含量显著下降（P＜0.01），效果优于单独使用HPC干预，明显降低了胰岛素抵抗大鼠的肝脏氧化应激能力，改善胰岛素抵抗[22-24]。

PPARγ是一类配体激活的核转录因子，当细胞接受Wnt信号刺激时，Wnt蛋白作为配体与细胞膜表面的Frizzled家族跨膜受体蛋白Dsh结合，Dsh通过磷酸化被激活，通过Dsh的DIX和PDZ结构域抑制GSK-3β破坏复合物Axin/GSK-3/APC活性，β-catenin能够积聚并定位于细胞核，随后通过基因转导以及T细胞因子/淋巴增强因子诱导Wnt蛋白表达，如PPARγ转录降低，使外周组织对胰岛素的敏感性和灵敏性降低，而发生胰岛素抵抗[25-27]。胰岛素抵抗大鼠同时摄取HPC和VC，与模型组比较，Wnt1的mRNA和蛋白相对表达水平极显著降低（P＜0.01），分别降低了35.61%和38.25%，FRET信号明显减弱，Wnt1与Dsh之间的结合力明显减弱，形成的异源二聚体数量明显减少，Axin、GSK-3β、APC的mRNA相对表达水平极显著升高（P＜0.01），β-catenin的mRNA和蛋白相对表达水平极显著降低（P＜0.01），PPARγ的mRNA和蛋白相对表达水平极显著升高（P＜0.01），初步说明HPC+VC联合作用通过Wnt/β-catenin通路减轻胰岛素抵抗大鼠氧化应激，且HPC和VC为食物中的植物活性成分和营养素，值得进一步提取研究和开发，从而应用于临床预防和治疗疾病[28-30]。

综上所述，HPC和VC联合应用改善胰岛素抵抗大鼠肝脏氧化应激与Wnt/β-catenin通路调节PPARγ有关，但是二者联合如何抑制Wnt1蛋白分泌的机制有待于进一步研究探索。