长链非编码RNA SERTAD1-1在结直肠癌中的表达及意义

陈志健 缪禄声 袁浩南 张旺发 孔连广 魏宜胜

【关键词】结直肠癌;增殖;迁移;长链非编码RNA;癌基因SEI1;

结直肠癌是常见的消化道肿瘤之一，其发病率、病死率高且逐年上升，预后较差[1]。肿瘤转移是结直肠癌患者死亡的主要原因，因而探究结直肠癌的发生发展机制，为结直肠癌靶向治疗提供科学基础，对于提高结直肠癌的治愈率至关重要。然而，目前仍未完全清楚结直肠癌肿瘤进展的具体机制。据相关研究，已知在这一过程中涉及到多基因的异常表达，如PIK3CA的基因突变、癌基因Ras的激活、抑癌基因p53的失活等，这些都是编码蛋白的基因[2-4]。此外，尚有不编码蛋白质的RNA，称为非编码RNA（ncRNA），在结直肠癌进展过程中起重要的调控作用[2]。

長链非编码RNA（lncRNA）是一类位于胞浆或细胞核部分、长度大于200个核苷酸的RNA，lncRNA基本不参与编码蛋白，也属于ncRNA，可通过参与遗传、转录和转录后调控等多个层面调节疾病的发生、发展[5]。相关研究表明，lncRNA广泛参与生理和病理各个过程，特别在癌症中具有重要的调节作用[6]。癌基因SEI1（又名SERTAD1或TRIP-Br1）是一个位于19q13.1至19q13.2的细胞周期调控基因，在许多癌症中该基因均有异常表达。SEI1基因产物p34SEI1是Sertad家族的一部分，它是一种周期蛋白依赖激酶4（CDK4）结合蛋白，通过促进CDK4–CCND复合物的缔合和刺激CDK4的活性来对抗p16对细胞周期进程的抑制活性[7-8]。相关研究显示SERTAD1的过表达与头颈癌有关[9]。此外，SERTAD1差异表达还与多种癌症类型相关，例如肺癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、白血病和淋巴瘤[10]。通过生物信息学分析序列对比，查找SERTAD1，发现该编码基因附近存在lncRNA，即lnc-SERTAD1-1，其染色体位置非常靠近SERTAD1，作为上游因子的一个反式作用因子与顺式作用元件结合，参与基因表达的调控。目前，关于lnc-SERTAD1-1在结直肠癌中的功能和作用机制报道较少。本研究组旨在分析lnc-SERTAD1-1在结直肠癌中的表达水平及对预后的影响，探究lnc-SERTAD1-1对结直肠癌增殖及转移的影响，以期为结直肠癌治疗提供新的靶标。

材料与方法

一、材料

1.标本

收集2009年3月至2012年2月广州医科大学附属第二医院胃肠外科的125例结直肠癌患者的标本（手术切除），标本为配对的癌组织和癌旁正常组织（距癌组织≥5cm的边缘）。本组结直肠癌患者的入选标准：①接受切除术且术后病理活组织检查（活检）明确诊断为结直肠癌;②术前均未进行放射治疗、化学治疗或其他抗癌治疗;③术后随访结果完整，生存、复发和转移等情况明确。排除标准：①非原发性结直肠癌者;②家族性息肉病恶变者。所有结直肠癌患者的肠癌及癌旁正常组织标本采集以RNA保护液处理并以液氮保存。术后随访以首次诊断之日为起点，总生存以术后死亡为随访终点。术后出现复发转移作为无病生存的随访终点。术后第1年每3个月随访1次，之后每6个月门诊随访1次。随访方式以电话、微信和门诊复查相结合。随访截止时间为2018年2月，随访时间中位数为83个月，所有患者均签署知情同意书，且本研究经广州医科大学附属第二医院医学伦理委员会批准。

2.细胞株

人结直肠癌细胞HCT15及人源胚胎细胞293T均由广州医科大学分子流行病学实验室吕嘉春教授惠赠。正常人结肠组织细胞CCD-18Co购自杭州美森细胞生物有限公司。HCT15用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养，CCD-18Co、293T用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，置于37℃、5%二氧化碳细胞培养箱内，当细胞生长的融合度为70%～80%时，取生长状态好的细胞用于实验。

二、试剂与仪器

BiooPureTMRNAIsolationReagent购自BiooScientific，DEPC处理水购自北京莱索宝科技有限公司，PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser购自Takara，TE缓冲液购自北京莱索宝科技有限公司，SYBRGreen实时定量PCR试剂盒购自DBIBioscience;lnc-SERTAD1-1引物委托广州复能基因有限公司合成，7900T荧光定量PCR仪购自cABI，-80℃超低温冰箱购自ThermoScientific，ND-1000自动紫外分光光度计购自ThermoScientific，SM-F123制冰机购自SANYO;Multiskan全自动酶标仪购自ThermoFisher;低速离心机购自中佳;FRESCO17高速低温离心机购自Thermo。

三、研究方法

1.RNA的提取

采用BiooPureTMRNAIsolationReagent法提取总RNA，紫外分光光度计测定波长260～280nm处的吸光度，计算OD260/280，鉴定RNA纯度。并随机抽取几对样品的癌组织及癌旁正常组织RNA进行核酸电泳，结果显示RNA的量是相对准确可信的。

2.实时荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）检测lnc-SERTAD1-1的表达

提取总RNA后定量，逆转录为cDNA。lnc-SERTAD1-1引物，上游5-TTTGGGACTTTCGGAGCAG-3，下游5-GACTTCAGGGCAATAGGA-3;β-actin引物，上游5-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3，下游5-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3。qRTPCR结束后用2-△Ct法处理实验数据，其中，中位数及以上（≥0.000970）为高表达，中位数以下（<0.000970）则为低表达。

3.细胞稳定转染及慢病毒感染靶细胞构建细胞系

应用GeneCopoeiaLentiPacHIV慢病毒表达系统按实际说明书进行实验操作，将含有目的基因lnc-SERTAD1-1过表达的质粒及含有空白载体质粒分别与转染试剂混合，得到2种试剂混合液，通过转染，制备并收集对应的病毒液。采取稳定转染的方法将2种病毒液分别感染靶细胞HCT15，构建含有目的基因lnc-SERTAD1-1过表达的HCT15（HO）及含有空载体质粒的HCT15（HOC），最后通过药物筛选去除未稳定转染成功的HCT15，最终得到实验所需的细胞。稳定转染后，得到HOC及HO继续培养细胞并提取细胞RNA，逆转录成cDNA行qRT-PCR验证，实验重复4次，明确HO过表达lnc-SERTAD1-1。

4.平板克隆形成实验

将稳转成功并经药物筛查的2种细胞HO及HOC以200个/孔接种于6孔板中，每种细胞3个副孔，置于37℃、5%二氧化碳细胞培养箱培养14d后，去上清，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，4%多聚甲醛溶液固定15min，0.1%结晶紫溶液染色20min，染色后对肉眼可见的克隆团进行计数，计算克隆形成率（克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%），实验重复6次。

5.细胞迁移实验（Transwell）

将稳定转染成功并经药物筛查的2种细胞HO及HOC消化并适度稀释，用血细胞计数板计数细胞密度。将200μl（5×104个）细胞悬液接种于小室上层，将600μl含20%血清的RPMI1640培养基加至小室下层。置于37℃、5%二氧化碳细胞培养箱培养24h，取出小室，用PBS洗2～3次，用棉签擦除小室膜上层未穿过膜的细胞，用4%多聚甲醛溶液固定20min，室温干燥小室，0.1%结晶紫染色30min，用干净棉签再次擦除未穿过小室的小室上层细胞，用流动水冲洗小室上多余的结晶紫，室温干燥小室。使用100倍倒置显微镜，随机选择5个视野拍照，然后计算细胞数，实验重复5次。

6.蛋白免疫印迹法

将稳转成功并经药物筛查后的2种细胞HO及HOC传代于6孔板中，每种细胞3个复孔，置于37℃、5%二氧化碳细胞培养箱培养。待细胞生存状态良好，融合度达70%～80%时，分别提取这2种细胞的蛋白，按蛋白免疫印迹法常规操作步骤验证下游蛋白SERTAD1在HOC和HO的表达水平，实验重复4次。

四、统计学处理

运用SPSS19.0、GraphPadPrism8.0处理实验结果，并进行统计分析，符合正态分布的定量资料用表示，组间比较采用t检验，方差不齐采用校正t检验;非正态分布的定量资料用M（P25，P75）表示，组间比较采用MannWhitneyU检验。lnc-SERTAD1-1在癌组织与癌旁正常组织中的表达水平比较采用符号秩和检验;lnc-SERTAD1-1表达水平与患者临床病理特征之间的相关性用χ2检验。根据lnc-SERTAD1-1的表达水平中位数分为lnc-SERTAD1-1低表达和lnc-SERTAD1-1高表达，<0.000970为低表达组，≥0.000970为高表达组。计算结直肠癌患者总生存期（OS）及无病生存期（DFS），采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，logrank检验对比生存曲线，分析lnc-SERTAD1-1表达对结直肠癌患者生存率的影响。采用多因素Cox比例风险模型（进入法）评估lnc-SERTAD1-1的表达水平及不同临床病理特征与患者预后的关系，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、lnc-SERTAD1-1在癌组织与癌旁正常组织中的表达水平

采用qRT-PCR检测lnc-SERTAD1-1的表达水平。lnc-SERTAD1-1在结直肠癌组织中的表达水平低于癌旁正常组织，比较差异有统计学意义（Z=-5.188，P<0.001），见图1。73.6%（92/125）的样品检测到lnc-SERTAD1-1在癌组织中的表达低于配对的癌旁正常组织，见图2。

二、lnc-SERTAD1-1在CCD-18Co与HCT15中的表达

采用qRT-PCR检测lnc-SERTAD1-1在CCD-18Co与HCT15中的表达水平，结果提示lnc-SERTAD1-1在CCD-18Co中的表达高于HCT15（n=4，t=4.565，P=0.004），见图3。

低表达为lnc-SERTAD1-1在癌组织中的表达比配对的癌旁正常组织低的例数;高表达为lnc-SERTAD1-1在癌组织中的表达比配对的癌旁正常组织高的例数

三、lnc-SERTAD1-1的表达与结直肠癌临床病理特征的关系

125例结直肠癌患者中lnc-SERTAD1-1低表达样本（2-△Ct<0.000970）62例（49.6%）。直肠癌患者、肿瘤直径<5cm者及大体分型为肿块型者，其lnc-SERTAD1-1的表达水平越低，见表1。

四、结直肠癌患者不同临床病理特征与生存率的多因素分析

采用Cox比例风险模型进行多因素预后分析，结果显示，肿瘤大体分型为环窄型、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期是结直肠癌患者术后OS和DFS的独立危险因素;年龄>60岁是结直肠癌患者术后OS的独立危险因素，但不是结直肠癌DFS的独立危险因素;lnc-SERTAD1-1高表达则是结直肠癌患者OS及DFS的独立保护因素，见表2。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，125例结直肠癌患者的1年生存率、3年生存率、5年生存率分别為96.0%、82.4%、67.2%，见图4A。lnc-SERTAD1-1低表达组与高表达组1年生存率分别为93.5%、98.4%，3年生存率为69.4%、95.2%，5年生存率为50.0%、82.5%，log-rank检验提示，lnc-SERTAD1-1低表达组的生存率比lnc-SERTAD1-1高表达组低（P<0.001），见图4B。

五、稳定转染后lnc-SERTAD1-1在HOC与HO中的表达

采用qRT-PCR验证稳定转染后的HOC和HO中lnc-SERTAD1-1的表达，结果提示lnc-SERTAD1-1在HO中的表达高于HOC（n=4，t'=-12.019，P<0.05），见图5。

六、lnc-SERTAD1-1对结直肠癌细胞增殖的作用

平板克隆实验检测lnc-SERTAD1-1对结直肠癌细胞克隆形成的影响。在HO中，细胞克隆形成数低于HOC（n=6，t'=-2.569，P=0.039），见图6。结果提示lnc-SERTAD1-1抑制结直肠癌细胞克隆形成。

七、lnc-SERTAD1-1对结直肠癌细胞的迁移作用

使用Transwell小室检测HO体外迁移能力。对lnc-SERTAD1-1过表达后，观察到HO穿过Transwell小室的数量较HOC少（n=5，t=7.120，P<0.001），见图7。实验结果表明，lnc-SERTAD1-1抑制结直肠癌细胞的体外迁移。

八、蛋白免疫印迹法检测下游蛋白SERTAD1在HOC与HO中的表达

多次行蛋白免疫印迹法检测下游蛋白SERTAD1在HOC与HO中的表达水平，结果提示，SERTAD1在HO中的表达高于HOC（n=4，t=-108.530，P<0.001），见图8。

讨论

lncRNA可参与肿瘤的增殖、分化、浸润及转移等过程，可发挥促癌或抑癌作用。相关研究表明，SERTAD1是一种癌基因，在营养不良和饥饿条件下可促进肿瘤发生和程序性细胞死亡（PCD）[11]。Mongre等[12]报道SERTAD1在大多数癌症（例如浸润性乳腺癌、胶质母细胞瘤、畸胎瘤、骨髓瘤和胰腺导管癌）中起着潜在的致癌作用。虽然上述研究表明SERTAD1发挥癌基因作用，但也有其他研究表明其在不同类型的癌症中发挥相反的作用。Xi等[13]发现，在结直肠癌中SERTAD1的表达是降低的，与SERTAD1作为潜在的肿瘤抑制因子的功能一致。

本研究显示，结直肠癌组织中lnc-SERTAD1-1的表达量较相应的癌旁正常组织低，lnc-SERTAD1-1在肠癌细胞中的表达亦低于正常肠黏膜细胞。这与Xi等[13]研究结果一致，提示lnc-SERTAD1-1与SERTAD1可能存在正相关关系，调控该基因的表达。分析该组病例中lnc-SERTAD1-1与其临床病理特征的关系，发现肿瘤部位、直径及肿瘤的大体分型与结直肠癌中lnc-SERTAD1-1的表達相关，结直肠癌中lnc-SERTAD1-1的低表达以直肠癌、肿瘤直径<5cm、肿瘤大体分型为肿块型者更为多见，并且lnc-SERTAD1-1的高表达是结直肠癌OS的独立保护因素，也是结直肠癌患者术后DFS的独立保护因素。随后的人群预后关联分析提示lnc-SERTAD1-1高表达是结直肠癌患者OS、DFS的独立保护因素，明确了lnc-SERTAD1-1对结直肠癌预后的意义。鉴于此，我们进一步行体外实验，平板克隆实验结果显示在HCT15中，HOC的细胞克隆形成率低于HOC;细胞迁移实验结果显示HOC的迁移能力弱于HOC。以上体外功能实验结果显示，lnc-SERTAD1-1过表达抑制了结直肠癌细胞的增殖和迁移，提示lnc-SERTAD1-1可能对结直肠癌起抑癌作用。

本研究为了验证lnc-SERTAD1-1与SERTAD1之间可能存在正相关的关系，对HOC及HO进行了转录水平及蛋白水平的检测，结果提示，lnc-SERTAD1-1和下游蛋白SERTAD1在HO中的表达量均高于HOC，提示质粒成功导入HCT15中，且lnc-SERTAD1-1与SERTAD1存在正相关关系。目前，有关lnc-SERTAD1-1与结直肠癌关系的研究极少，lnc-SERTAD1-1在结直肠癌中的分子作用机制的研究更为罕见。本研究结果提示了lnc-SERTAD1-1可抑制结直肠癌细胞的增殖与迁移，其在结直肠癌中作为一种抑癌分子参与肿瘤发生、发展及转移是有可能的。

本研究尚存在一些不足，lnc-SERTAD1-1与临床病理特征的相关分析数据仅来源于单中心，应增加样本量，寻求多中心多地区合作，进行更具代表性的调查研究。本研究初步验证了lnc-SERTAD1-1对结直肠癌的抑癌作用，为深入研究结直肠癌发病及进展机制提供了理论依据，有望用于指导临床治疗及术后随访，但更深入的作用机制及临床应用尚待进一步研究。