蛋白酶体抑制剂MG132改善胶原诱导性关节炎模型大鼠炎症反应的研究①

蹇孝丽 师 萍 周 艳 冯琳琳 蒋红梅 （贵州医科大学医学检验学院，贵阳550004）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫性疾病，常引起关节不可逆损伤，进而导致关节功能障碍［1］。有研究显示RA 患者血清及滑膜组织中促炎因子TNF-α、IL-6 表达水平升高，而IL-4、IL-10 等抑炎因子表达水平降低，且这些炎症因子的异常表达与关节长期遭受破坏密切相关［2-3］。因此，平衡RA 患者体内促炎因子与抑炎因子的表达可能是治疗RA的一种有效措施。

泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin proteasome path⁃way，UPP）是一种蛋白质选择性降解的主要途径，可参与到细胞周期、细胞凋亡、炎症反应、细胞内信号传导等过程［4］。最近研究显示UPP 参与多种疾病的炎症反应过程，并在其中发挥非常重要的作用，抑制UPP 途径的活性可能会改善某些疾病的炎症反应［5-6］。MG132是一种蛋白酶体抑制剂，属于醛基肽类，有研究报道MG132 可以减轻多种疾病的炎症反应，并减少相关炎症因子的产生［6-8］。目前关于UPP在RA 相关炎症反应过程中的研究报道较少，本研究以牛Ⅱ型胶原构建胶原诱导性关节炎（collageninduced arthritis，CIA）模型大鼠，通过注射蛋白酶体抑制剂MG132 进行干预，旨在观察MG132 对CIA 大鼠关节病理改变、血清炎症相关因子TNF-α、IL-6 和IL-10表达水平的影响，讨论蛋白酶体抑制剂MG132在胶原诱导性关节炎大鼠炎症反应中的作用，为临床用药和基础研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级雌性SD 大鼠48 只，购自重庆动物中心，体重约190 g，适应性饲养1 周后开始实验。

1.1.2 主要试剂及仪器 牛Ⅱ型胶原（BIIC，批号：C7806）和弗氏完全佐剂（FCA，批号：F5881）购自Sigma 公司；MG132（批号：S2619）购自Selleck 公司；大鼠 TNF-α ELISA 试剂盒 96t（批号：ERC-102a）购自欣博盛生物科技有限公司；大鼠IL-6 ELISA 试剂盒96t（批号：JRE-04）购自安徽巧伊生物科技有限公司；大鼠IL-10 ELISA 试剂盒96t（批号：BMS629）购自eBioscience 公司；恒温水浴锅ELX800 酶标仪购自Bio-Tek。

1.2 方法

1.2.1 建立关节炎模型 将适应性饲养1 周的48 只 SD 大鼠随机分为 3 组，即对照组、CIA 模型组和MG132干预组，每组16只。参考课题组此前建模方法建立CIA 大鼠模型［9］：将牛Ⅱ型胶原溶液与FCA等体积混合，乳化成混悬乳剂，取200 μl多点注射于大鼠左后足跖部皮内。加强免疫于尾根部同法注射胶原乳剂，在初次免疫后第14天进行。对照组大鼠同法注射相同剂量生理盐水。

1.2.2 MG132干预过程 用一定剂量的二甲基亚砜（DMSO）溶解MG132，使MG132最终浓度为5 mg/ml，置于-20℃冰箱备用。在造模后第21 天，以皮下注射方式注射 MG132 进行干预，剂量为 1 mg/kg［9］，每天1 次，连续注射14 d。其余两组大鼠注射相同剂量的溶媒剂DMSO。在造模第42 天，即给予MG132干预后隔1 周，处死大鼠采血并分离关节滑膜组织做相应检测。

1.2.3 观察指标

1.2.3.1 一般情况观察 观察各组大鼠在用牛Ⅱ型胶原造模前后MG132 干预前后关节红肿情况、毛色变化、进食情况、精神活动状态及排泄物和体重等变化。

1.2.3.2 关节炎指数 分别在初次免疫后第7、14、21、28、35 及 42 天观察各组大鼠四肢足趾关节、跖关节和踝关节的肿胀情况。并根据各关节炎症情况进行关节炎指数（arthritis index，AI）评分。

1.2.3.3 关节病理观察 取左后肢剔除表面皮肤和肌肉组织，保留踝关节及滑膜组织，固定于10%的中性甲醛中1 d，12.5%EDTA-2Na 脱钙，制作石蜡切片，苏木素-伊红（HE）染色。光镜下观察踝关节软骨的增生和破坏情况、滑膜组织增生及炎症情况。

1.2.3.4 ELISA检测大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10的水平 操作步骤按照试剂盒说明书进行，各细胞因子的浓度通过绘制标准曲线计算得出。

1.3 统计学处理 数据分析使用R 统计分析软件（version 3.2.1）。计量资料以表示，两组间比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况及关节炎指数的变化 对照组大鼠饮食正常、活动良好、反应迅捷、毛色光泽。注射牛Ⅱ型胶原后第7 天，CIA 模型组大鼠注射足开始缓慢出现红肿变化，并慢慢累及邻近和其他足关节，第14天加强免疫后随着时间的推移关节炎症状进展较快并逐渐加重，第21天关节红肿更加明显。随着时间的延长有些大鼠伴有行动迟缓、跛行以至活动障碍。MG132 干预组大鼠造模成功后，第21 天观察大鼠出现明显关节炎相关症状后再经皮下注射MG132 干预2 周；经干预后的大鼠关节肿胀程度较对照组有所减轻，且干预组大鼠较少出现关节功能障碍和行动迟缓等严重情况。见图1。

通过动态比较3组大鼠关节炎指数，造模第7天，CIA模型组和MG132干预组大鼠较对照组关节炎指数开始升高，第21天达到高峰。干预组经MG132干预后，关节炎指数明显下降，在建模第42天，该指数明显低于CIA模型组（P<0.05）。见图1。

图1 各组大鼠足趾关节观察及关节炎指数（AI）的比较Fig.1 Observation of toe joints and comparison of arthri⁃tis index（AI）

2.2 大鼠关节滑膜组织病理改变 对照组大鼠可见清晰的关节腔，关节软骨表面光滑，滑膜组织可见排列整齐的滑膜细胞和滑膜下组织，无炎症细胞浸润（图2A）。CIA 模型组大鼠关节内纤维组织增生、关节腔变狭窄、关节软骨破坏、关节面粗糙、周围可见大量新生血管和炎症细胞、滑膜组织细胞明显增厚（图2B）。MG132干预组大鼠关节损坏较轻、软骨破坏较少、滑膜组织细胞增生较轻、只见少量炎症细胞（图2C）。

图2 各组大鼠关节组织病理特征（HE染色，×200）Fig.2 Histological characteristics of ankle joints of rats（HE staining，×200）

2.3 大鼠血清炎症相关因子TNF-α、IL-6、IL-10 水平的比较 与对照组相比，CIA 模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6 的含量明显增高（P<0.01），IL-10 的含量明显减少（P<0.01）。与CIA 模型组比较，MG132干预组血清 TNF-α、IL-6 的含量显著降低，IL-10 的含量显著增高（P<0.01）。见表1。

表1 各组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10含量的比较（，n=16）Tab.1 Comparison of TNF-α，IL-6 and IL-10 contents of serum in rats（，n=16）

表1 各组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10含量的比较（，n=16）Tab.1 Comparison of TNF-α，IL-6 and IL-10 contents of serum in rats（，n=16）

Note：Compared with Mock group，1）P<0.01；compared with Collagen group，2）P<0.01.

Groups Mock Collagen MG132 intervention TNF-α（pg/ ml）56.24±10.27 86.48±24.801）50.82±11.122）IL-6（pg/ ml）53.69±10.05 138.72±62.571）68.12±17.842）IL-10（pg/ ml）123.28±42.50 76.49±29.811）113.76±40.622）

3 讨论

本研究结果显示蛋白酶体抑制剂MG132 可以明显减轻牛Ⅱ型胶原诱导性关节炎模型大鼠关节肿胀症状，减少关节组织炎症细胞浸润，降低大鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-6 表达水平，升高血清中抑炎因子IL-10表达水平。

RA 的病理特征主要是慢性的关节滑膜炎症和纤维组织增生，长期严重的炎症反应会使关节破坏，最终导致残疾［1］。研究显示RA患者关节滑膜内大量炎症细胞浸润和血管翳的形成，都与细胞因子失调，主要是促炎因子和抑炎因子表达异常有关［10］。之前的研究显示，RA 患者体内的 TNF-α 与IL-6 活性水平呈明显升高趋势。TNF-α 及 IL-6 是重要的促炎因子，可参与活化单核巨噬细胞、成纤维细胞等，对RA 患者病程进展起到加重的作用，其血清表达水平与患者的严重程度呈正相关关系［11-12］。本研究结果亦显示CIA模型组大鼠血清中TNF-α和IL-6表达水平与对照组比较显著升高。与TNF-α和IL-6 不同，IL-10 是一种抑炎因子，其能抑制某些细胞因子如 TNF-α、IL-6 及 IL-8 的活性，还能抑制软骨细胞和滑膜成纤维细胞中 IL-1 和 TNF 的表达［13］。本研究结果显示CIA 模型组大鼠血清中IL-10 表达水平与对照组相比显著降低。

长期的炎症反应是导致RA 进展及恶化的主要原因，因此控制炎症反应在治疗RA 中显得极为重要。目前虽有抗风湿药、非甾体抗炎药等用来治疗RA，但这些药物的治疗效果有限［14］。泛素-蛋白酶体途径作为细胞内重要的蛋白质降解途径，亦可调控炎症相关蛋白，在炎症反应过程中充当着极为重要的角色［15-16］。在调控多种炎症基因表达的过程中，NF-κB是最为重要的转录因子，经各种因素刺激活化后可以增加多种炎症因子如TNF-α、IL-6、环氧化酶等的表达，而增加的这些炎症因子又能进一步活化NF-κB，导致整个炎症过程反复进行并加重［17］。抑制NF-κB 的激活可以降低炎症因子的释放，从而改善RA 的炎症反应［18］。研究显示蛋白酶体抑制剂MG132 可通过抑制NF-κB 的活化及转录以减轻分枝杆菌及佐剂诱导的关节炎大鼠的炎症疼痛反应［19］。本课题组前期研究结果亦显示蛋白酶体抑制剂MG132 可以通过减少IκB 蛋白的降解，使NF-κB 无法与结合蛋白 IκB 解离从而抑制 NF-κB 的活性，减轻RA大鼠的炎症反应［9］。

本实验在前期研究基础上，用蛋白酶体抑制剂MG132 对CIA 模型大鼠进行干预，进一步检测大鼠血清促炎因子TNF-α、IL-6 和抑炎因子IL-10 的表达水平。结果显示，在MG132 干预后，大鼠血清中TNF-α 和IL-6 表达水平显著下降，关节受累现象也得到明显改善，而IL-10 水平明显升高。促炎因子TNF-α、IL-6 表达水平主要受 NF-κB 通路调控，MG132 可能是通过抑制NF-κB 的活化和转录从而降低相关炎症因子TNF-α、IL-6 的表达；但其升高IL-10水平的机制有待进一步探讨。

综上所述，本研究显示蛋白酶体抑制剂MG132能有效降低 CIA 大鼠 TNF-α、IL-6 表达水平，同时提高IL-10 表达水平，对改善CIA 大鼠炎症症状，缓解疾病的进一步发展起到积极作用。