FGD5-AS1 调控miR-133a-3p 对脓毒症血管内皮细胞的细胞活性、凋亡及炎症因子表达的影响

杨 燕 刘德智 （新乡市中心医院，新乡医学院第四临床学院重症医学科二区，新乡453000）

脓毒症是一种由感染引起的全身炎症反应综合征，而血管内皮细胞在脓毒症发生过程中发挥重要作用［1-2］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可促进血管内皮细胞炎症反应从而诱导细胞凋亡最终造成细胞损伤［3-4］。目前关于脓毒症血管内皮细胞损伤发生的分子机制尚未完全阐明，因而深入探究脓毒症血管内皮细胞损伤机制有助于提高诊断及治疗效果。长链非编码RNA FGD5-AS1（long non-coding RNA FGD5-AS1，LncRNA FGD5-AS1）在牙周炎中呈低表达，并可影响牙周炎发生及发展过程［5］。生物信息学分析显示微小RNA-133a-3p（microRNA-133a-3p，miR-133a-3p）可能是 FGD5-AS1 的靶基因，研究表明miR-133a-3p 在脓毒症患者血清中表达上调，并可能作为诊断脓毒症的分子标志物［6］。但FGD5-AS1 是否可通过调控miR-133a-3p 的表达从而影响脓毒症发生及发展过程尚未可知。本研究通过LPS 诱导血管内皮细胞构建脓毒症模型，观察FGD5-AS1 与miR-133a-3p 在细胞模型中的表达变化，分析其对细胞增殖、凋亡及炎症因子表达水平的影响，为揭示脓毒症血管内皮细胞损伤的分子机制提供新方向。

1 材料与方法

1.1 材料 20只清洁级SD大鼠体重200～220 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（湘）：2016-0013；LPS 购自美国 Sigma 公司（货号：I2880，生产批号：20170320）；膜联蛋白V（An⁃nexin V）-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（propid⁃ium iodide，PI）细胞凋亡试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司（货号：MK1025，生产批号：2017-0410）；TNF-α、IL-1、IL-6 ELISA 检测试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司；杜氏改良培养基（DMEM）、胰蛋白酶、胎牛血清购自美国Thermo Fisher 公司；Lipofectamine 2000 购自美国 Invitrogen 公司（货号：11668，生产批号：20170316）；pcDNA3.1购自上海远慕生物科技有限公司；miR-133a-3p寡核苷酸模拟物（miR-133a-3p mimics）及阴性对照 mimic NC 序列（miR-NC）、FGD5-AS1 小干扰 RNA（si-FGD5-AS1）、乱序无意义阴性序列（si-NC）购自广州锐博生物科技有限公司；Trizol、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa 公司；甲基噻唑基四唑（me⁃thylthiazolyl tetrazolium，MTT）购自上海泽叶生物科技有限公司（货号：ZY111105-500，生产批号：20170412）；双荧光素酶活性检测试剂盒购自北京威格拉斯生物技术有限公司；RIPA、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量检测试剂盒、增强型化学发光试剂（ECL）购自北京全式金生物技术有限公司；兔抗鼠P21、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 原代培养大鼠血管内皮细胞［7］取20只SD大鼠，麻醉后处死，将大鼠头部置于75%酒精，切除脑组织，去除颅骨，分离脑组织，PBS洗涤，剥离软脑膜与大血管，去除大脑蛋白质，PBS洗涤，使用75 μm滤网过滤，取滤网上的血管段，PBS 洗涤，4℃下1 500/rmin 离心8 min，加入Ⅱ型胶原酶，37℃恒温水浴锅孵育 15 min，1 500/rmin 离心 5 min，吹打混匀，1 500/rmin离心5 min，加入DMEM完全培养基，接种于培养皿中，置于37℃恒温培养箱培养，待细胞生长融合度达到90%时进行传代培养。

1.2.2 实验分组 取对数期血管内皮细胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培养基制备细胞悬液，调整细胞密度2×105个/ml，接种于6孔板（100 μ/l孔），使用含有10 mg/ml的LPS处理细胞24 h（LPS组），以此模拟脓毒症环境［8］。未经处理的细胞作为control组。待细胞生长融合度达到70%时将培养基更换为不含血清的培养基，分别将pcDNA3.1、pcDNA3.1-FGD5-AS、pcDNA3.1-FGD5-AS1 与 miR-NC、pcDNA3.1-FGD5-AS1及miR-133a-3p转染至血管内皮细胞，转染6 h后将培养基更换为DMEM完全培养基，转染方法与步骤参照Lipofectamine 2000说明书，继续培养48 h，随后使用含有10 mg/ml LPS 的培养基继续培养24 h，分别记作 LPS+pcDNA3.1 组、LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS 组、LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-NC 组、LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-133a-3p组。

1.2.3 qRT-PCR检测细胞中FGD5-AS1、miR-133a-3p的表达水平 采用Trizol法提取各组细胞中总RNA，应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA 浓度。FGD5-AS1 正向引物5'-TACAGTGCAGTGGTG⁃GCTTA-3'，反向引物 5'-AGGCACCCACTTATCAAGCT-3'；miR-133a-3p 正向引物 5'-CCCTTTGGTCCC-CTTCAAC-3'，反向引物5'-CAGTGCAGGGTCCGAG⁃GTAT-3'；GAPDH 正向引物 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，反向引物 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'；U6 正向引物 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物：5'-GGAACGCTTCAC⁃GAATTTG-3'，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。按照反转录试剂盒说明书操作将总RNA 反转录为cDNA，以cDNA 为模板进行qRTPCR 反应，反应条件：95℃ 2 min（循环 1 次），95℃30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s（循环40次）。FGD5-AS1以GAPDH 为内参，miR-133a-3p 以 U6 为内参，采用2-ΔΔCt法计算 FGD5-AS1、miR-133a-3p相对表达量。

1.2.4 MTT 检测细胞增殖 收集对数期血管内皮细胞，调整细胞密度 3×104个/ml，接种于 96 孔板（100 μ/l孔），按照1.2.2分组处理，每孔中加入20 μl MTT溶液，室温孵育4 h，弃上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min，应用酶标仪检测各孔吸光度值（OD490nm），计算细胞存活率。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率 收集各组对数期血管内皮细胞（1×104个/ml），预冷PBS 洗涤，4℃ 下1 000/rmin离心5 min，收集细胞，加入500 μl Binding Buffer，分别加入5 μl Annexin V-FITC 与 5 μl PI，充分混匀，室温避光孵育20 min，应用FACS Cali⁃bur流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6 ELISA 检测 TNF-α、IL-1、IL-6 浓度 收集各组细胞培养上清液，采用ELISA 法检测各组TNF-α、IL-1、IL-6水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.7 双荧光素酶报告基因检测FGD5-AS1的靶基因 Starbase 预 测显示 FGD5-AS1 与 miR-133a-3p 存在结合位点，将含有结合位点及突变位点的序列片段分别插入荧光素酶报告基因载体构建野生型质粒WT-FGD5-AS1 与突变型质粒MUT-FGD5-AS1，分别将 WT-FGD5-AS1、MUT-FGD5-AS1 与 miR-NC、miR-133a-3p mimics 共转染至血管内皮细胞，培养48 h，参照荧光素酶活性检测试剂检测各组相对荧光素酶活性。分别将pcDNA3.1、pcDNA3.1-FGD5-AS1、si-NC、si-FGD5-AS1转染至血管内皮细胞，qRT-PCR检测各组细胞中miR-133a-3p的表达水平。

1.2.8 Western blot检测P21、Caspase-3蛋白表达 收集各组细胞，加入RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，根据BCA 试剂盒说明书检测蛋白浓度，蛋白高温变性，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离蛋白，电泳结束后将分离的蛋白凝胶转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，孵育一抗稀释液（1∶1 000），4℃ 孵育过夜，TBST洗涤，孵育，加入二抗稀释液（1∶2 000），室温孵育1 h，TBST洗涤，曝光，显影，应用Image J软件分析各条带灰度值。

1.3 统计学处理 应用SPSS21.0统计学软件分析数据，计量资料以表示且均符合正态分布，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，任意两组间比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS 作用下 FGD5-AS1、miR-133a-3p 在血管内皮细胞中的表达 与Control 组相比，LPS 组血管内皮细胞中FGD5-AS1的表达水平显著降低（P<0.05），miR-133a-3p的表达水平显著升高（P<0.05），见表1。

表1 LPS 作用下 FGD5-AS1、miR-133a-3p 在血管内皮细胞中的表达（，n=9）Tab.1 Expression of FGD5-AS1 and miR-133a-3p in vas⁃cular endothelial cells under effect of LPS（，n=9）

表1 LPS 作用下 FGD5-AS1、miR-133a-3p 在血管内皮细胞中的表达（，n=9）Tab.1 Expression of FGD5-AS1 and miR-133a-3p in vas⁃cular endothelial cells under effect of LPS（，n=9）

Note：Compared with control group，1）P<0.05.

miR-133a-3p 0.98±0.10 2.69±0.251）19.052<0.001 Groups Control LPS t P FGD5-AS1 1.02±0.10 0.34±0.031）19.540<0.001

2.2 过表达FGD5-AS1 对LPS 作用的血管内皮细胞的细胞活性、凋亡的影响 结果见图1、表2。与Control 组相比，LPS 组血管内皮细胞存活率显著降低（P<0.05），细胞凋亡率显著升高（P<0.05），P21、Caspase-3 蛋白相对表达量显著升高（P<0.05）；与LPS+pcDNA3.1 组相比，LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1组血管内皮细胞存活率显著升高（P<0.05），细胞凋亡率显著降低（P<0.05），P21、Caspase-3蛋白相对表达量显著降低（P<0.05）。

表2 过表达FGD5-AS1对LPS作用的血管内皮细胞的细胞活性、凋亡的影响（，n=9）Tab.2 Effects of overexpression of FGD5-AS1 on cell activity and apoptosis of LPS-induced vascular endothelial cells（，n=9）

表2 过表达FGD5-AS1对LPS作用的血管内皮细胞的细胞活性、凋亡的影响（，n=9）Tab.2 Effects of overexpression of FGD5-AS1 on cell activity and apoptosis of LPS-induced vascular endothelial cells（，n=9）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with LPS+pcDNA3.1 group，2）P<0.05.

Apoptosis rate（%）8.01±1.00 26.64±2.531）27.12±2.65 13.32±1.222）209.007<0.001 Groups Control LPS LPS+pcDNA3.1 LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1 F P FGD5-AS1 1.01±0.10 0.32±0.031）0.33±0.03 0.85±0.082）249.808<0.001 P21 0.22±0.02 0.72±0.071）0.74±0.07 0.33±0.032）230.568<0.001 Caspase-3 0.34±0.03 0.86±0.091）0.90±0.09 0.41±0.042）165.738<0.001 Viability rate（%）100.26±10.15 53.58±5.421）52.97±5.40 88.14±8.432）90.197<0.001

图1 过表达FGD5-AS1 对LPS 作用的血管内皮细胞凋亡及P21、Caspase-3蛋白表达的影响Fig.1 Effects of FGD5-AS1 overexpression on LPS-in⁃duced apoptosis of vascular endothelial cells and ex⁃pressions of P21 and Caspase-3 proteins

2.3 过表达FGD5-AS1对LPS作用的血管内皮细胞中炎症因子表达的影响 与Control 组相比，LPS 组血管内皮细胞中炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6 水平显著升高（P<0.05）；与LPS+pcDNA3.1 组相比，LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1 组血管内皮细胞中炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6水平显著降低（P<0.05），见表3。

表3 过表达FGD5-AS1对LPS作用的血管内皮细胞中炎症因子表达的影响（，n=9，pg/ml）Tab.3 Effect of overexpression of FGD5-AS1 on the expression of inflammatory factors in LPS-affected vascular endothelial cells（，n=9，pg/ml）

表3 过表达FGD5-AS1对LPS作用的血管内皮细胞中炎症因子表达的影响（，n=9，pg/ml）Tab.3 Effect of overexpression of FGD5-AS1 on the expression of inflammatory factors in LPS-affected vascular endothelial cells（，n=9，pg/ml）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with LPS+pcDNA3.1 group，2）P<0.05.

IL-6 134.56±12.67 367.38±32.341）372.15±31.68 167.82±14.852）238.660<0.001 Control LPS LPS+pcDNA3.1 LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1 F P 72.02±7.00 183.24±15.021）182.16±15.14 93.51±8.522）212.734<0.001 94.61±8.43 235.06±21.271）237.15±20.69 126.59±11.422）180.394<0.001 GroupsTNF-αIL-1

2.4 FGD5-AS1 靶向、调控 miR-133a-3p Starbase预测显示FGD5-AS1 与miR-133a-3p 存在结合位点，见图2。双荧光素酶报告实验结果显示，转染野生型质粒 WT-FGD5-AS1 的细胞中，miR-133a-3p 组荧光素酶活性显著低于miR-NC 组（P<0.05）；转染突变型质粒MUT-FGD5-AS1的细胞中，miR-133a-3p组与miR-NC 组荧光素酶活性相比差异无统计学意义（P>0.05），见表4。qRT-PCR检测结果显示，与pcD⁃NA3.1组相比，pcDNA3.1-FGD5-AS1组细胞中miR-133a-3p 的表达水平显著降低（P<0.05）；与si-NC 组相比，si-FGD5-AS1 组细胞中miR-133a-3p 的表达水平显著升高（P<0.05），见表5。

表4 双荧光素酶报告实验（，n=9）Tab.4 Double luciferase report assay（，n=9）

表4 双荧光素酶报告实验（，n=9）Tab.4 Double luciferase report assay（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

MUT-FGD5-AS1 1.02±0.10 0.95±0.10 1.485 0.157 Groups miR-NC miR-133a-3p t P WT-FGD5-AS1 1.00±0.10 0.22±0.021）22.946<0.001

表5 FGD5-AS1调控miR-133a-3p的表达（）Tab.5 FGD5-AS1 regulates expression of miR-133A-3p（）

表5 FGD5-AS1调控miR-133a-3p的表达（）Tab.5 FGD5-AS1 regulates expression of miR-133A-3p（）

Note：Compared with pcDNA3.1 group，1）P<0.05；compared with si-NC group，2）P<0.05.

miR-133a-3p 1.01±0.10 0.29±0.031）0.98±0.10 2.61±0.252）417.076<0.001 Groups pcDNA3.1 pcDNA3.1-FGD5-AS1 si-NC si-FGD5-AS1 n9 9 9 9 F P

图2 FGD5-AS1靶向miR-133a-3pFig.2 FGD5-AS1 targeted miR-133-a-3p

2.5 过表达miR-133a-3p 能逆转FGD5-AS1 对LPS作用的血管内皮细胞的细胞活性、凋亡的影响 与LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-NC 组 相 比，LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-133a-3p 组细胞存活率显著降低（P<0.05），细胞凋亡率显著升高（P<0.05），P21、Caspase-3蛋白相对表达量显著升高（P<0.05），见图3、表6。

表6 过表达miR-133a-3p能逆转FGD5-AS1对LPS作用的血管内皮细胞的细胞活性、凋亡的影响（，n=9）Tab.6 Overexpression of miR-133a-3p can reverse effect of FGD5-AS1 on cell activity and apoptosis of LPS-affected vascu⁃lar endothelial cells（，n=9）

表6 过表达miR-133a-3p能逆转FGD5-AS1对LPS作用的血管内皮细胞的细胞活性、凋亡的影响（，n=9）Tab.6 Overexpression of miR-133a-3p can reverse effect of FGD5-AS1 on cell activity and apoptosis of LPS-affected vascu⁃lar endothelial cells（，n=9）

Note：Compared with LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-NC group，1）P<0.05.

Apoptosis rate（%）13.06±1.31 24.10±2.371）12.231<0.001 Groups LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-NC LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-133a-3p t P miR-133a-3p 1.03±0.10 2.28±0.231）14.952<0.001 P21 0.31±0.03 0.63±0.061）14.311<0.001 Caspase-3 0.39±0.40 0.79±0.081）13.416<0.001 Viability rate（%）88.06±8.16 55.61±5.491）9.898<0.001

图3 过表达miR-133a-3p能逆转FGD5-AS1对LPS 作用的血管内皮细胞凋亡及P21、Caspase-3蛋白表达的影响Fig.3 Overexpression of miR-133a-3p reversed effect of FGD5-AS1 on LPS-induced apoptosis of vascular endothelial cells and expression of P21 and Cas⁃pase-3 proteins

2.6 过表达miR-133a-3p 能逆转FGD5-AS1 对LPS作用的血管内皮细胞中炎症因子表达的影响 与LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-NC 组 相 比，LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-133a-3p 组细胞中炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6 的水平显著升高（P<0.05），见表7。

表7 过表达miR-133a-3p能逆转FGD5-AS1对LPS作用的血管内皮细胞中炎症因子表达的影响（，n=9，pg/ml）Tab.7 Overexpression of miR-133a-3p reversed effect of FGD5-AS1 on expression of inflammatory cytokines in LPS-af⁃fected vascular endothelial cells（，n=9，pg/ml）

表7 过表达miR-133a-3p能逆转FGD5-AS1对LPS作用的血管内皮细胞中炎症因子表达的影响（，n=9，pg/ml）Tab.7 Overexpression of miR-133a-3p reversed effect of FGD5-AS1 on expression of inflammatory cytokines in LPS-af⁃fected vascular endothelial cells（，n=9，pg/ml）

Note：Compared with LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-NC group，1）P<0.05.

IL-6 168.34±15.14 336.64±31.281）14.529<0.001 LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-NC LPS+pcDNA3.1-FGD5-AS1+miR-133a-3p t P 94.26±8.83 156.36±14.691）10.870<0.001 127.15±11.63 204.42±20.131）9.971<0.001 GroupsTNF-αIL-1

3 讨论

脓毒症发生时常伴随多器官衰竭，并可加重炎症反应从而造成组织或器官损伤，研究表明Ln⁃cRNA 可通过靶向miRNA 参与多种炎症反应发生过程［9］。既往研究显示LncRNA 异常表达可参与脓毒症急性肺损伤发生过程［10］。因而探讨与脓毒症诱导的炎症反应相关分子机制有助于降低心脏、肺部等多器官障碍的发生率。

FGD5-AS1 在牙周炎、急性心肌梗死等疾病中呈低表达，并可能参与多种疾病发生及发展过程［11-12］。但FGD5-AS1 在脓毒症血管内皮细胞中的表达尚未可知。本研究通过LPS诱导血管内皮细胞模拟脓毒症引起的炎症环境，结果显示FGD5-AS1在LPS 诱导的血管内皮细胞中表达下调，与上述研究报道结果相似。提示FGD5-AS1 表达量降低可能加重脓毒症所致炎症反应。脓毒症患者血清中炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6水平升高，降低炎症因子水平可有效改善血管内皮细胞功能［13］。本研究结果显示LPS 诱导的血管内皮细胞中TNF-α、IL-1、IL-6水平升高，而FGD5-AS1过表达后细胞中TNF-α、IL-1、IL-6 水平明显降低，提示FGD5-AS1 过表达可能通过降低炎症反应从而改善血管内皮细胞功能。细胞增殖与凋亡的失衡可促进多种疾病发生及发展，研究表明P21可负向调控细胞周期，抑制细胞增殖，Caspase-3 作为细胞凋亡的执行因子，其可诱导细胞凋亡［14-15］。本研究结果显示LPS 处理后，血管内皮细胞存活率显著降低，细胞凋亡率升高，P21、Cas⁃pase-3表达量升高，而FGD5-AS1过表达能够明显逆转这一反应，提示FGD5-AS1 过表达可能通过下调P21、Caspase-3 表达从而抑制LPS 诱导的血管内皮细胞凋亡，促进细胞增殖。

miR-133a-3p 在慢性阻塞性肺疾病中异常表达并可能参与疾病发生及发展过程［16］。研究表明CX⁃CL12/CXCR4 通过激活miR-133a-3p 从而促进炎症反应［17］。本研究结果显示LPS诱导的血管内皮细胞中miR-133a-3p 的表达水平明显升高，miR-133a-3p过表达联合FGD5-AS1 过表达处理后，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率升高，P21、Caspase-3 表达量升高，TNF-α、IL-1、IL-6 水平明显升高，说明 miR-133a-3p过表达能够逆转FGD5-AS1过表达对LPS诱导的血管内皮细胞增殖、凋亡及炎症因子表达的影响。提示FGD5-AS1 过表达可能通过下调miR-133a-3p 的表达从而抑制LPS 诱导的血管内皮细胞凋亡及炎症反应，并可促进细胞增殖。

综上所述，LPS 诱导的血管内皮细胞中FGD5-AS1 表达降低，miR-133a-3p 表达增加，炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6 水平升高，凋亡率增加，存活率降低，而FGD5-AS1 过表达可靶向调控miR-133a-3p 的表达从而促进LPS 诱导的血管内皮细胞存活，抑制细胞凋亡，降低TNF-α、IL-1、IL-6 水平，为进一步探讨FGD5-AS1 调控炎症反应的机制奠定理论基础，FGD5-AS1 可能为脓毒症与并发症潜在的治疗靶点。本研究将进一步探讨FGD5-AS1 在脓毒症或其他炎症性疾病中的调控作用机制及其对其他信号通路的调控作用。