Super-ARMS法检测肺腺癌患者血浆循环肿瘤DNA表皮生长因子受体T790M基因突变的临床研究

周傲雪 史亮 李琨 车南颖 刘喆

肺癌是全世界范围内导致癌症相关死亡的主要原因之一，其中约85%～90% 是非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC），而腺癌占大多数[1]。EGFR 是NSCLC 发生发展的主要驱动基因，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）的研发显著改善了NSCLC 患者的预后，然而9～14个月的无进展生存期（progression-free survival，PFS）后获得性耐药是不可避免的[2-4]。具有EGFR 敏感突变的患者在第一代或第二代EGFR-TKIs 治疗过程中出现疾病进展，约有50%病例出现T790M 耐药突变[5-7]，第三代EGFR-TKIs 如奥希替尼对EGFR T790M 突变患者有较好的疗效[8]。因此，在第一、二代EGFRTKIs 失败后，检测EGFR T790M 突变是决定后续治疗策略的重要步骤[9-11]。然而，在肺癌患者的临床治疗中，可能存在无法使用侵入性方法（如支气管镜和穿刺活检）对复发部位进行再活检的情况，因此需要易于获取的外周血标本进行液体再活检。本研究旨在评估真实世界中EGFR-TKIs 治疗进展后，外周血ctDNA 中检测EGFR T790M 突变对NSCLC 患者的临床策略和预后的影响。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集2019年1月至2020年6月于首都医科大学附属北京胸科医院确诊的307例肺腺癌患者资料。纳入标准: 1）病理确诊为肺癌；2）病理类型为腺癌；3）有完整的临床病理信息，包括吸烟、性别、年龄等。排除标准：1）年龄<18 岁；2）怀孕女性。共计纳入307例肺腺癌患者（图1）。本研究是一项回顾性、单中心临床研究，由本院伦理委员会批准。

图1 患者入组流程

仪器及试剂：Mx3000P 即时荧光定量PCR 仪购自美国Aglient 公司，Qubit 荧光定量仪购自美国Thermo Fisher Scientific 公 司，Applied Biosystems 9700PCR 仪购自美国Thermo Fisher Scientific 公司，QIAamp CirculatingNucleic Acid Kit 购自德国Qiagen公司，ADxSuper-ARMS EGFR 基因位点检测试剂盒购自厦门艾德生物医药科技股份有限公司，人血液样本EGFR 基因检测试剂盒购自上海源奇生物医药科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 组织标本和血液标本收集 所有患者通过CT导引下经皮肺肿物穿刺或经支气管镜取活检等方法收集肿瘤组织标本。收集到的标本使用4%甲醛溶液浸泡，经包埋固定后制成石蜡切片。苏木精伊红（H&E）染色，在显微镜下病理学专家进行细胞类型确诊，保证80%以上的肿瘤细胞成分，通过显微切割移除非肿瘤成分。QIAamp DNA 试剂盒定量提取石蜡切片肿瘤组织的DNA。血液样本的收集：利用EDTA 抗凝管，抽取10 mL 的静脉血液样本，离心后分离4 mL血浆。血浆游离肿瘤DNA 采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit 提取。上述提取的DNA 样本采用Qubit 荧光定量仪检测浓度。

1.2.2 Super-ARMS 技术检测患者血浆中EGFR 基因突变类型 通过Super-ARMS 技术检测患者血浆中EGFR 基因突变类型，此部分结果均从本院病理科获得。血浆ctDNA EGFR 基因突变结果的敏感度与特异度以肿瘤组织检测结果为金标准。

1.2.3 疗效评估 依据RECIST 1.1 标准进行肿瘤治疗疗效评估。PFS 定义为有EGFR 基因敏感突变的肺癌患者从接受EGFR-TKIs 治疗开始，至观察到疾病进展或发生因任何原因死亡的时间。末次随访时间为2020年11月。

1.3 统计学分析

采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析。通过Kaplan-Meier 法分析患者PFS。以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 患者临床病理特征

纳入的307例肺腺癌患者中，179例患者接受第一代或第二代EGFR-TKIs 治疗后疾病进展，153例腺癌患者进行再活检。其中男性57例，女性96例，中位年龄64（26～84）岁；接受组织再活检74例，接受液体再活检141例，同时接受组织再活检和液体再活检62例。患者的基线临床特征，包括年龄、性别、吸烟状态、美国东部肿瘤协作组（ECOG）评分、基因突变类型和临床分期见表1。

表1 153例接受再活检肺腺癌患者的临床特征

2.2 EGFR-TKIs 治疗进展后肺癌组织EGFR 基因突变检测结果

179例患者在EGFR-TKIs 治疗后进展。74例患者进行组织再活检，组织再活检标本来源：58例（78.4%）为肺穿刺，8例（10.8%）为胸水沉淀包埋，3例（4.0%）为淋巴结穿刺活检，5例（6.8%）为支气管活检标本。其中34例（45.9%）存在EGFR T790M 基因突变，其中18例（52.9%）存在Exon19 del 突变合并Exon20 T790M 突 变，16例（47.1%）存 在Exon21 1858R 突变合并Exon20 1790M 突变。接受组织再活检患者中有62例进行血液样本再活检。

2.3 EGFR-TKIs 治疗进展后血浆EGFR 基因突变检测结果

179例EGFR-TKIs 治疗后进展的患者中，141例患者进行血液样本再活检，应用Super-ARMS 技术检测到血浆ctDNA 中EGFR T790M 基因突变51例（36.2%）。45例存在Exon19 del 突变，其中31例合并Exon20 T790M 突变；59例存在Exon21 L858R 突变，其中20例合并Exon20 T790M 突变；1例Exon18 G719X 突变；41例EGFR 检测阴性。以组织检测结果作为金标准，62例患者的血液Super-ARMS 检测敏感度为22.2%，特异性为71.4%，与组织检测的符合度为50.0%（表2）。

表2 患者肿瘤组织与外周血中EGFR T790M 突变状态比较 例

2.4 组织与血浆EGFR T790M 基因突变患者接受第三代EGFR-TKIs 治疗后疗效分析

EGFR T790M 基因耐药突变患者中, 73例接受了第三代EGFR-TKIs 药物治疗，将可评估的患者进行生存分析，组1 为血浆检测EGFR T790M 突变阳性42例，组2 为组织检测EGFR T790M 突变阳性31例。组织EGFR T790M 突变阳性患者接受第三代EGFR-TKIs 的 中 位PFS 为16.3 个月（95%CI：7.5～25.2），外周血EGFR T790M 突变阳性患者为11.4 个月（95%CI：7.0～15.8），两者相比差异无统计学意义（x2=1.138，P>0.05），提示外周血检测阳性和组织检测阳性患者在接受第三代EGFR-TKIs 治疗后，对患者PFS 影响无显著性差异。再活检EGFR T790M阴性且未接受第三代EGFR-TKIs 药物治疗患者40例（组3），其中位PFS 为8.3 个月（95%CI：5.8～10.8）。组1、组2与组3 之间差异有统计学意义（x2=9.69，P<0.05，图2）。

图2 Kaplan-Meier 分析组织与血浆EGFR T790M 基因突变患者接受第三代EGFR-TKIs 治疗后的PFS

2.5 组织与血浆EGFR T790M 基因突变阴性患者未接受第三代EGFR-TKIs 治疗后的疗效分析

EGFR T790M 基因突变阴性患者中，将可评估的患者进行生存分析（图3），组1 为血浆检测EGFR T790M 突变阴性者36例，组2 为组织检测EGFR T790M 突变阴性22例。组织EGFR T790M 突变阴性患者未接受第三代EGFR-TKIs 治疗患者的中位PFS 为7.0 个月（95% C1：6.0～8.0），外周血EGFR T790M 突变阴性患者为7.0 个月（95% CI：4.4～9.6）,两者比较差异无统计学意义（x2=0.470，P>0.05），提示外周血检测阴性和组织检测阴性患者在未接受第三代EGFR-TKIs 治疗，接受其他治疗方案后，对患者PFS 影响无显著性差异（P>0.05）。

3 讨论

再活检对EGFR-TKIs 耐药的患者后续治疗策略具有关键作用，然而临床中并非所有患者均可进行组织再活检。既往临床研究显示，患者EGFR-TKIs 耐药后组织再活检比例仅约50%[12-13]。本研究回顾性分析了153例肺腺癌患者的临床特征，患者经过第一代或第二代EGFR-TKIs 治疗后病情进展，并进行了再活检，其中接受组织再活检74例，接受外周血液体再活检141例，同时接受组织再活检和外周血液体再活检62例。在179例接受第一代或第二代EGFRTKIs 治疗后进展的患者中进行组织再活检比例（41.3%，74/179）与既往研究相比略低[12-13]。可能由于不接受或身体状况不能耐受再活检的患者较多。在本研究中，再活检患者中检测到的EGFR T790M 突变的频率为51.6%（79/153），与既往研究数据一致[14-15]。

本研究中，73例患者在检测EGFR T790M 突变后接受了第三代EGFR-TKIs 治疗，并对可评估的患者进行第三代EGFR-TKIs 疗效评估。研究发现，组织EGFR T790M 突变阳性患者接受三代EGFRTKIs 后的中位PFS 为16.3 个月（95% C1：7.5～25.2），与既往大型临床研究结果一致[8,15-16]，外周血EGFR T790M 突变阳性患者为11.4 个月（95% CI：7.0～15.8），两者相比差异无统计学意义（P>0.05），两者与再活检T790M 阴性且未接受第三代EGFR-TKIs 药物治疗组比较差异有统计学意义（P<0.05）。EGFR T790M 基因突变阴性患者中，将可评估的患者进行生存分析，组织EGFR T790M 突变阴性患者未接受第三代EGFR-TKIs 的中位PFS 为7.0 个月（95% C1：6.0～8.0），外周血EGFR T790M 突变阴性患者为7.0 个月（95% CI：4.4～9.6），两者生存曲线趋势相似，提示外周血检测阳性和组织检测阴性患者在未接受第三代EGFR-TKIs 治疗的情况下接受其他治疗方案，对患者PFS 影响无显著性差异。

上述结果提示液体再活检结果可以一定程度上替代组织再活检，用于无组织标本进行再活检的耐药后患者；且EGFR T790M 阳性患者接受第三代EGFRTKIs 治疗后PFS 优于T790M 阴性未接受第三代EGFR-TKIs 治疗患者。在真实世界中，患者医嘱依从性可能比参与临床试验的患者低，当患者拒绝接受、不能耐受组织再活检或组织再活检有效成分较少时，液体活检结果可能是一种替代方法，可指导耐药后的治疗。

本研究同时发现组织和液体标本两种检测结果均为阳性的病例，接受第三代EGFR-TKIs 治疗后的中位PFS 较仅一种检测呈阳性者短，可能是由于两种检测均为阳性的病例且多数存在远处转移，肿瘤负荷大，故疗效较差，但该结论仍需进一步验证。

本研究存在一定局限性：1）本研究为单中心进行的回顾性研究，与之前的研究相比，血浆样本和组织样本中EGFR T790M 检测的一致性率相对较低，提示基于ARMS 的方法存在局限性；2）组织再活检的时间和液体再活检的时间均为第一代或第二代EGFR-TKIs治疗进展后，但未完全匹配；3）本研究使用的PCR 检测系统中，EGFR T790M 突变的存在仅被报道为“检测到”或“未检测到”，因此无法估计EGFR T790M 突变的丰度，即肿瘤细胞在所有EGFR 突变细胞中的比例。

综上所述，靶向药物耐药后再活检在NSCLC EGFR-TKIs 耐药患者的治疗中发挥了关键作用，随着诊断技术的发展，在组织标本获取困难的情况下，液体活检可能是一种很好的补充替代选择。Super-ARMS法检测血浆ctDNA EGFR T790M 基因突变状态具有可行性, 真实世界中可以在临床上用于指导后续治疗和疗效评价。