蓝芩口服液HPLC指纹图谱的建立与分析

高 芳

蓝芩口服液的药物组成有板蓝根、黄芩、栀子、黄柏、胖大海，具有清热解毒和利咽消肿的功效，因此临床上主要用于治疗急性咽炎、肺胃实热证所致的咽痛、咽干、咽部灼热等病症[1]。由于蓝芩口服液是自主开发的一款中成药，目前蓝芩口服液的临床研究根据其抗病毒的作用，对病毒在体内和口腔的复制和繁殖具有有效的阻断作用，可用于小儿手足口病[2, 3]、腮腺炎[4]、水痘[5]、儿童病毒性心肌炎[6]、疱疹性咽峡炎[7]和上呼吸道感染[8]等疾病；根据其抗菌消炎的作用，通过抑制枯草杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等多种细菌，可治疗慢性咽炎[9]、急性扁桃体炎[10]、口腔溃疡[11]等疾病。随着蓝芩口服液在临床上使用的广泛性增强，对蓝芩口服液药品质量的监控就越重要。目前对蓝芩口服液的药理研究较少，基于蓝芩口服液处方中中药药材和成分多且繁杂，本研究将基于高效液相色谱法(HPLC)建立蓝芩口服液的指纹图谱并对其进行分析，为制定蓝芩口服液有效的药品质量控制提供科学的参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器型号为2695的Acquity HPLCTM系统购于美国Waters公司；型号为KH3200B超声波清洗器购于昆山禾创超声仪器有限公司；型号MS-TS的电子分析天平购于上海梅特勒-托利多有限公司。

1.2 试剂盐酸小檗碱对照品(批号：110713-200911)；黄芩苷对照品(批号：110715-201016)；黄芩素对照品(批号：111595-200905)；腺苷对照品(批号：110879-200202)、苯甲酸对照品(批号：100419-200301)均购于北京普天同创生物科技有限公司。色谱纯甲醇和乙腈购于美国Sigma公司；色谱纯磷酸购于天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.3 分析药品蓝芩口服液(规格：10 ml，批准文号：国药准字Z19991005，生产厂商：扬子江药业集团)，分别采用不同批次17042021、17050221、17052722、17052821、17041832、17042721、17042521、17050432、17050331、17050232等10个不同批次。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：型号为XBridge BEH HPLC C18，规格为4.6 mm×250 mm，粒径5 μm；柱温：30 ℃；进样量：10 μl。流动相是以乙腈∶0.2%磷酸水溶液作为A∶B流动相；梯度洗脱：洗脱时间为70 min。整个梯度流动洗脱程序中流速控制在1 ml/min；检测波长：230 nm。见表1。

表1 乙腈∶0.2%磷酸水溶液(A∶B)梯度流动洗脱程序

2.2 混合对照品溶液配制分别精密称取盐酸小檗碱对照品、黄芩素对照品、腺苷对照品、苯甲酸对照品，加入甲醇充分溶解，而黄芩苷对照品仅用70%甲醇进行溶解，最终配制成盐酸小檗碱对照品、黄芩苷对照品、黄芩素对照品、腺苷对照品、苯甲酸对照品浓度分别为4.55 μg/ml、96.00 μg/ml、10.50 μg/ml、7.54 μg/ml、161.00 μg/ml，即得混合对照品溶液，置于4 ℃冰箱保存。

2.3 供试品溶液配制采用移液器精密取200 μl蓝芩口服液于5 ml容量瓶中，加入甲醇进行定容(以容量瓶刻度为宜)，封口摇动充分混合均匀，用0.45 μm的有机过滤膜过滤即为蓝芩口服液供试品溶液。

2.4 专属性实验根据2.2和2.3配制的混合对照品溶液、供试品溶液，同时在此基础上配制阴性对照进行专属性测验，以板蓝根为例，结果表明采用HPLC研究蓝芩口服液供试品溶液具有良好的专属性。见图1。

图1 专属性实验

2.5 线性关系考察根据HPLC指纹图中对照品保留时间和紫外光谱，对5种指标性成分进行回归方程分析。结果显示蓝芩口服液中的盐酸小檗碱对照品、黄芩苷对照品、黄芩素对照品、腺苷对照品、苯甲酸对照品均具有良好的线性关系，见表2。

表2 蓝芩口服液中各主要成分对照品的线性关系考察结果

2.6 精密度实验在精密实验中将取同一批次蓝芩口服液供试品溶液连续进样6次，考察HPLC指纹图谱色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果显示盐酸小檗碱对照品、黄芩苷对照品、黄芩素对照品、腺苷对照品、苯甲酸对照品的HPLC指纹图谱色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3%，即说明精密度良好。

2.7 稳定性实验在稳定性实验中，取同一份蓝芩口服液供试品溶液于4 ℃冰箱中静置，时间依次为0、2、4、6、8、10、12、24 h，计算HPLC指纹图谱色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果显示盐酸小檗碱对照品、黄芩苷对照品、黄芩素对照品、腺苷对照品、苯甲酸对照品的HPLC指纹图谱色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均<3%，即说明蓝芩口服液供试品溶液在静置24 h内均能保持良好的稳定性。

2.8 重复性实验取同一批蓝芩口服液供试品溶液共6份，在相同的色谱条件进行测定，计算HPLC指纹图谱色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果表明，6份同一批号的蓝芩口服液供试品溶液HPLC指纹图谱色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均<2.0%，表明本研究HPLC指纹图谱法具有良好的重复性。

2.9 回收率实验精密称取已知含量的蓝芩口服液供试品溶液各5 ml，每一份均加入等量的对照品溶液，混合均匀后，对混合液和各个对照品溶液分别逐级稀释，共检测3次，检测蓝芩口服液供试品溶液的平均回收率，结果盐酸小檗碱对照品、黄芩苷对照品、黄芩素对照品、腺苷对照品、苯甲酸对照品平均回收率分别为(100.24±1.05)%、(99.44±0.86)%、(100.53±1.00)%、(100.34±0.92)%、(99.88±0.58)%，盐酸小檗碱对照品、黄芩苷对照品、黄芩素对照品、腺苷对照品、苯甲酸对照品的RSD分别为1.35%、1.22%、2.02%、0.93%、1.17%，说明方法的准确度良好。见表3。

表3 加样回收率结果

2.10 样品检测结果

2.10.1 蓝芩口服液指纹图谱的建立根据国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，导入10批蓝芩口服液色谱图，“时间窗”宽度为0.1 min，研究采用样品5生成对照谱，指纹图谱相似度评价系统经过多点矫正和数据匹配生成色谱指纹图谱，并对指纹图谱进行共有模式分析，提示所检测10批蓝芩口服液质量稳定。见图2、图3。

图2 10批蓝芩口服液HPLC指纹图谱

图3 蓝芩口服液共有模式指纹图谱

2.10.2 蓝芩口服液成分的含量分析取10个不同批次的蓝芩口服液进行成分含量分析，不同批次的蓝芩口服液成分含量有一定的差异。见表4。

表4 蓝芩口服液成分的含量分析

3 讨论

3.1 色谱柱的选择XBridge BEH色谱柱是具有独特选择性的色谱柱，能够为HPLC分离平台提供操作稳定性和方法可扩展性。该色谱柱可消除吸附剂选择带来的影响，在HPLC研究中可灵活选用各种流动相、温度和pH条件进行分析；常规HPLC操作方法即可有效分离最具挑战性的样品混合物。并且XBridge BEH色谱柱能去除流动相液体中可能存在的颗粒污染物和化学污染物，从而在不影响色谱性能的前提下改善分析柱性能。若是在多种固定相选择中亦能够实现针对各种化合物的选择性和保留性，同时不牺牲性能属性(例如碱性化合物的优异峰形、低柱流失、出色的批间重现性和高柱效等)。本研究中发现XBridge BEH色谱柱可通过减小峰宽和增大峰高来改善系统性能，从而最大限度提升分析物灵敏度，且能够在分离度和样品通量之间实现完美平衡，并将现有HPLC方法的效率提升4倍[12]。

3.2 蓝芩口服液药理分析近年来，随着现代药理研究的深入，蓝芩口服液在临床运用范围得到不断扩展，本研究成分分析主要有5种成分盐酸小檗碱、黄芩苷、黄芩素、腺苷、苯甲酸。盐酸小檗碱为黄柏中的主要成分，对枯草杆菌、卡他球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白喉杆菌、脑膜炎双球菌、肺炎球菌、溶血性链球菌等多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有较强的抑制作用[13]；有研究显示黄柏可收缩血管，通过降低毛细血管通透性和减少单核细胞渗出和巨噬细胞生成，进而减少炎性渗出和抑制慢性炎症肉芽肿的形成，有效缓解急性炎症的肿胀度[14]。黄芩苷、黄芩素均是黄芩的主要成分之一，黄芩苷通过抑制体内和口腔中病毒的复制和繁殖，从而阻断病毒起到有效的抗病毒作用[15]；而黄芩素则抑制促炎因子的分泌起到良好的消炎作用[16]。蓝芩口服液中的腺苷可抑制炎症早期的水肿和渗出，苯甲酸可抑制炎症晚期的组织增生和肉芽组织的形成[1]。