基于网络药理学探讨六君子汤治疗非小细胞肺癌的作用机制*

王寅宇 周喆聿

肺癌是最为常见的癌症，2018年我国新发肺癌774323例，发病率居于我国癌症的首位，占总病例的21.9%[1]。而在所有肺癌患者中，有80%为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)患者[2]。肺癌在中医上属于“肺积”“息贲”等范畴，其发病机制与肾精不足有关[3]。六君子汤则有益气补肾的功效。临床上也有用六君子汤辅助化疗的实例[4]。但中药方剂普遍存在多靶点、多途径、多环节的治疗特点，有效成分与靶点之间相互作用不明确等问题，因此六君子汤治疗NSCLC的潜在机制仍不明了。

网络药理学是近年来基于高通量组学数据分析、计算机模拟技术及网络数据库检索发展而来的研究方法[5]，用整体、系统的相互作用关系网络来探究中药方剂的药理机制，与中医药研究的整体观、辨证施治的特色不谋而合[6]。因此，本研究旨在利用网络药理学方法探讨六君子汤治疗NSCLC的作用机制，为六君子汤发挥作用的机制提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 中药化学成分的搜集和整理六君子汤由人参、白术、茯苓、甘草、陈皮和半夏6味中药组成。利用TCMSP数据库(https://tcmspw.com/tcmsp.php)依次检索其全部化学成分，并以口服利用度(OB)≥30%，类药性(DL)≥0.18[7]作为活性化合物的筛选条件(其中甘草的筛选条件为OB≥50%，DL≥0.18)[8]。

1.2 中药预测作用靶点的搜集与整理通过Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)搜集活性化合物成分的SMILES结构，并上传至Swiss Target Prediction平台(http://www.swisstarget prediction.ch/)，应用反向药效团匹配方法得到虚拟筛选结果(筛选条件为probability>0)，运用Microsoft Excel 2010将所得结果进行删重整理。

1.3 NSCLC疾病靶点的搜集与整理以“non-small cell lung caner”为关键词在GeneCards(https://www.genecards.org/)、PharmGKB(https://pharmgkb.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)[9]数据库搜索疾病靶点，汇总成表格并整合删重，得到结果保存以备后续分析。

1.4 交集靶点的筛选及蛋白质—蛋白质相互作用(PPI)网络的构建采用R软件(v4.0.2)并引用venn package,筛选出中药预测作用靶点与NSCLC疾病靶点的交集，绘制韦恩图，并用String数据库(https://string-db.org/)对交集靶点进行PPI网络构建，其中将生物种类设为“Homo sapiens”，最低相互作用置信度得分设为“custom value”(0.99)，简化显示设为“隐藏网络中断开连接的节点”，其他参数保持默认设置，将得到的数据以TSV.格式导出。

1.5 核心靶点的筛选将String中得到的PPI网络图上传至Cytoscape 3.7.2(https://cytoscape.org/)软件，使用cytoNCA插件，以网络中节点“Betweenness”“Closeness”“Degree”等参数大于中位值为条件对所得信息进行2次筛选，挑选出核心靶点。

1.6 基因本体(GO)功能富集分析为了说明中药化合物的靶点在基因功能中的作用，利用R软件(v 4.0.2)并引用BiocManager package(clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot和ggplot2)对筛选后的核心靶点进行GO功能富集分析。

1.7 基因组百科全书(KEGG)功能富集分析采用R软件(v 4.0.2)并引用BiocManager package(clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2和pathview)对核心靶点进行KEGG通路富集分析，绘制气泡图及通路图。

2 结果

2.1 活性化合物及靶点的筛选通过TCMSP分别搜索六君子汤中的6味中药，得到化合物104个，其中人参22个，白术7个，茯苓15个，甘草42个，陈皮5个，半夏13个，经去重后共得到101个化合物，记录化合物的MOL ID及名称，并将其作为候选化合物，通过Pubchem平台搜索化合物的SMILES结构。将化合物的SMILES结构提交到Swiss Target Prediction平台，属性设置为“Homo Sapiens”，得到6703个预测靶点。删去重复的靶点，共获得944个预测靶点。

2.2 疾病相关靶点的筛选与整理从GeneCards、PharmGKB和TTD数据库分别搜集到4910、305、154个疾病靶点，共计5369个疾病靶点，删重后得到5152个靶点。

2.3 交集靶点的筛选及蛋白质—蛋白质相互作用(PPI)网络的构建将疾病与药物的靶标基因取交集即可得到六君子汤治疗NSCLC的潜在靶点，共得579个交集靶点。见图1(a)。将579个交集靶点上传至String数据库即可得到PPI图，最低相互作用置信度得分设为”custom value”(0.99)。见图1(b)。共有579个节点，308条边，平均节点数为1.06，网络节点代表着各个靶点，线条代表着靶点之间的联系。

图1 中药和NSCLC靶点交集的韦恩图(a)及交集靶点的PPI图(b)

2.4 核心靶点的筛选将String中得到的PPI网络图上传至Cytoscape 3.7.2软件，使用cytoNCA插件进行分析，以网络中节点“Betweenness”“Closeness”“Degree”等参数大于中位值为条件共筛选2次得18个核心靶点。见图2。

图2 核心靶点图

2.5 GO功能富集分析利用R软件(v 4.0.2)对18个核心靶点进行GO功能富集分析，以Pvalue<0.05为筛选条件，共得到1482条富集结果。其中生物过程(Biological Process, BP)相关的共1339个，主要包括细胞因子合成的正向调控、骨髓细胞分化、细胞有丝分裂G1/S期的转换等方面；细胞组成(Cellular Component, CC)相关的条目46个，主要有转录调节复合物、转移酶复合物、膜筏、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物等方面；分子功能(Molecular Function,MF)相关的条目97个，主要包括丝氨酸/苏氨酸激酶活性、激素受体结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、DNA结合转录因子结合等方面。见表1。

表1 GO富集分类结果前10条目

2.6 KEGG 富集分析采用R软件(v 4.0.2)对核心靶点进行KEGG通路富集分析，以Pvalue<0.05为筛选条件，共得到131个相关通路，如通路hsa05223NSCLC通路。见图3。并根据qvalue的大小将KEGG富集结果前30条绘制成气泡图。见图4。

注：标红基因为六君子汤核心靶点对该通路的影响位点

图4 KEGG富集气泡图

3 讨论

六君子汤具有益气补肾、补气益脾的功效，有学者通过整理文献发现六君子汤在临床上可以治疗肿瘤疾病，如胃癌、肺癌、肠癌等，且具有显著的临床效果。本研究提示基于网络药理学分析了六君子汤治疗NSCLC的作用机制可能是通过CCND1、STAT3、PIK3CA、AKT1、CDK6、CDK4、EGFR、HRAS、MAPK3等9个基因位点作用于NSCLC通路。除了NSCLC通路，六君子汤的作用机制还可能与PD-L1在肿瘤中的表达与PD-1检查点通路、JAK-STAT、PI3K-Akt、VEGF、p53、Ras、mTOR、TGF-β、MAPK、AMPK、Wnt以及Notch信号通路等有关。

现代药理研究证明，黄芩素对NSCLC细胞的增殖能力存在抑制作用，并下调细胞内Notch1和hes-1的表达，通过抑制Notch信号通路来达到治疗的目的[10]。You[11]的实验则证明了黄芩苷可以使肿瘤细胞内SIRT1和AMPK表达的siRNA含量降低，通过AMPK通路抑制肿瘤细胞的增殖。此外，Liao等[12]的研究将虫草素与阿帕替尼相结合作用于肿瘤细胞，通过分子对接及western blot等技术测定肿瘤细胞内蛋白的改变，发现VEGF/PI3K/Akt通路被抑制，肿瘤细胞迁移和侵袭能力减弱。此外，Teng等[13]通过对肿瘤细胞使用中药延龄草的提取成分重楼皂苷，发现mTOR通路被重楼皂苷抑制，使肿瘤细胞发生自噬现象，达到抑制肿瘤细胞增殖的效果。

随着研究的深入，越来越多的与NSCLC相关的通路被人们发现，通过将人体双肺正常组织与NSCLC组织进行比较，Kang等[14]发现肿瘤组织中TGF-βRⅡ的表达部分降低，表明NSCLC的发生机制技能与TGF-β信号通路有关。Wu等[15]则在研究中发现肿瘤组织中IL-17AR的表达明显升高，而且IL-17RA和p38 MAPK信号通路的下游效应子MMP-2和MMP-9的含量升高明显，提示了IL-17信号通路也可能是NSCLC的发生有关。Levallet等[16]通过肿瘤组织进行免疫组织化学测定，发现其中β-微管蛋白III(TUBB3)出现高表达现象，提示可能与K-Ras基因突变有关，为之后的药物研究提供指导。

通过对肿瘤组织的研究，许多NSCLC的潜在靶点逐渐被人们发现，在许多肿瘤组织中均可发现细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CLTA4)的表达，但是具体机制并不明了，近年来有研究显示，通过MEK和ERK磷酸化的EGFR途径介导，抗CLTA4可以诱导肿瘤细胞PD-1的表达，使肿瘤细胞出现免疫逃逸现象[17]。有药物研究证明，HIF-1α/VEGF信号通路抑制剂PX-478能显着降低HIF-1α和VEGF蛋白的表达并抑制细胞增殖活性[18]。He等[19]研究发现抑制HEATR1可以使核糖体的生物发生减少，作用于p53信号通路，达到治疗NSCLC的效果。Li等[20]则在实验中证明了OTUB2可以激活mTOR通路，从而促进了肿瘤的发展进程，Zhang等[21]亦在肿瘤组织中的组蛋白甲基转移酶(G9a)可通过Wnt通路影响肿瘤的发生发展，为NSCLC的靶向治疗提供了一个新的潜在靶点。

本研究采用网络药理学的方法，探究六君子汤辨证治疗NSCLC的有关成分、靶点和通路的潜在作用机制，充分体现六君子汤治疗NSCLC多靶点、多途径、多通路的特点，在分子水平总结了六君子汤治疗NSCLC的机制，为NSCLC的中医药治疗提供了理论依据。