阴阳攻积丸成分分析及其中肉桂醛、6-姜酚、吴茱萸碱的含量测定*

郭文海 李 跃 邹增城 李义伟 李永伟

阴阳攻积丸(Yin Yang Gong Ji pill，YYGJ)源自《医宗必读》，系明朝李中梓创制，主治五积、六聚，七癥、八瘕，痰食等[1]。原文如下：“吴茱萸，干姜，官桂，炮川乌，各一两，炒黄连，洗半夏，橘红，茯苓，槟榔，炒厚朴，炒枳实，石菖蒲，炒延胡索，去芦人参，沉香、琥珀另研，桔梗各八钱，巴豆霜另研，五钱。以上各药为细末，皂角六两，煎汁，泛为丸，如绿豆大，每服八分，渐加至一钱五分，生姜汤送服”，功效为温中理气、化痰导滞、破癥散积[2]。本课题组前期实验研究证明该方可抑制HepG2细胞增殖，促进其凋亡，可调节肝癌上皮间质转换(EMT)的关键分子Vimentin和E-cadherin，抑制基质金属蛋白酶MMP，防止其溶解细胞外基质为转移提供条件，初步显示具有抑制肝癌的药效[3]。阴阳攻积丸全方共20味药，具体的化学成分尚不清楚，本研究采用TOF MS-IDA-TOF MS/MS数据采集方法定性检测所有成分，其中吴茱萸、肉桂和干姜为复方中3种同等剂量的主要用药，每味用量仅次于君药皂角，故采用高效液相定量检测这3种中药的成分吴茱萸碱、肉桂醛和6-姜酚，以了解阴阳攻积丸的疗效基础。

1 仪器与试药

液相：岛津公司30A超高效液相色谱系统；质谱：AB SCIEX公司API4000QTRAP质谱系统。对照品：吴茱萸碱(货号BWB50890[115416]，纯度HPLC≥99.52%)、6-姜酚(货号BWB50536[113429]，纯度HPLC≥98%)、肉桂醛(货号BWB50758[114206]，纯度HPLC≥98%)，均购自北京北纳生物。

阴阳攻积丸(批号20181111)，由本实验室自制，药材来源于中山大学附属第三医院中药房，经主任药师鉴定，分别按前述制备[3]，保存于4 ℃备用，4 g/粒。甲醇为色谱纯，由MERCK公司提供，实验用水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液精密称取对照品适量于10 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 供试品溶液称取40 mg药丸，加入25 ml的甲醇和水混合液(8∶2，v/v)，涡旋振荡5 min，放置30 min，14 000 r/min离心10 min，取上清液进行分析。

2.2 质谱条件采用TOF MS-IDA-TOF MS/MS数据采集方法，雾化气流量：55 L/min，辅助雾化气流量：50 L/min，气帘气流量：25 L/min，喷雾电压：5500 V(正离子)或-4500 V(负离子)，离子源温度：550 ℃，动态背景扣除功能打开。肉桂醛在(+)ESI 源电离方式下，主要生成[M+H]+峰为m/z 133。选择性对[M+H]+峰进行产物离子全扫描分析，肉桂醛生成的主要碎片离子分别为m/z 115 和m/z 105，将以上主要碎片离子作为定量分析时监测的产物离子。6-姜酚在(+)ESI 源电离方式下，发生源内裂解，主要生成[M+H]+峰为m/z 295.2。选择性对[M+H]+峰进行产物离子全扫描分析，6-姜酚生成的主要碎片离子分别为m/z 277.2和m/z 177.2，将以上主要碎片离子作为定量分析时监测的产物离子。吴茱萸碱在(+)ESI 源电离方式下，主要生成[M+H]+峰为m/z 304.2。选择性对[M+H]+峰进行产物离子全扫描分析，吴茱萸碱生成的主要碎片离子分别为m/z 134.2和m/z 171.2，将以上主要碎片离子作为定量分析时监测的产物离子。肉桂醛、6-姜酚、吴茱萸碱3个化合物在ESI正离子模式下检测，雾化气流量：55 L/min，辅助雾化气流量：50 L/min，气帘气流量：25 L/min，喷雾电压：5500 V，离子源温度：550 ℃。

2.3 色谱条件流动相A为水相，水；流动相B为有机相，甲醇。流速为0.4 ml/min。色谱柱：Phenomenex C18(2.1×50 mm, 5 μm)，柱温35 ℃，检测波长215 nm，290 nm，280 nm。优化后的洗脱梯度: 流动相B相在0.3 min比例为25%，在3.0 min B相比例线性上升至95%，维持至4.9 min，在5.0 min降至25%，总色谱洗脱时间为7.0 min。

2.4 定性结果除定量检测吴茱萸碱、6-姜酚和肉桂醛外，采用高分辨质谱法全扫描采集药物成分一级和二级信息，正离子模式的采集总离子流图见图1，负离子模式的采集总离子流图见图3。

注：粗线为一级MS总离子流图，细线为二级MS/MS总离子流图

所采集的数据搜索SCIEX公司中药数据库进行二级图谱匹配，匹配图谱见附图，蓝色离子为药丸中采集的目标物碎片离子，灰色离子为数据库中碎片离子，两者进行镜像对比，匹配度大于60%则认为匹配成功。综合鉴定结果药丸中含有沉香四醇、丁香醛、四氢小檗碱、小檗碱、香叶木素、小檗红碱、橘皮素、异甘草素、槲皮素等52种成分。见图3～图11。

注：粗线为一级MS总离子流图，细线为二级MS/MS总离子流图

图3 香叶木素

图4 小檗红碱

图5 小檗碱

图6 丁香醛

图7 四氢小檗碱

图8 沉香四醇

图9 橘皮素

图10 异甘草素

图11 槲皮素

2.5 线性关系考察称取“2.1.2”项下贮备液各2.0 ml，用50%甲醇依次稀释制成系列质量浓度对照品溶液，在“2.3”色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，各成分在各自范围内线性关系良好。见表1。

表1 阴阳攻积丸3种成分线性关系

2.6 重复性实验取阴阳攻积丸,按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，照上述色谱条件进样测定。吴茱萸碱、肉桂醛、6-姜酚 的RSD分 别 为1.08%、1.62%、0.98%(n=6)，表明本方法重复性良好。

2.7 精密度实验吸取对照品溶液10 μl，注入色谱仪，重复进样5次，记录峰面积。结果，吴茱萸碱、肉桂醛、6-姜酚 的RSD分 别 为1.08%、0.89%、1.32%(n=5)，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性实验取阴阳攻积丸,“2.1.2”项下供试品溶液,分别于0 h，3 h，6 h，12 h、14 h、16 h在上述色谱条件下测定。以峰面积为指标计算RSD考察供试品溶液的稳定性。结果吴茱萸碱、肉桂醛、6-姜酚在6个时间点所测各色谱峰峰面积的RSD分 别为0.9%、1.18%、1.29%(n=6),表明供试品溶液在16 h内稳定。

2.9 加样回收率实验取含有量已知的同1批丸剂适量，倾出内容物，混匀，精密称取5份，置于锥形瓶中，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液。在“2.3”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，肉桂醛、吴茱萸碱和6-姜酚平均加样回收率分别为100.79%、91.63%、98.77%，RSD分 别 为1.65%、1.95%、1.02%。见表2。

表2 加样回收率结果 (n=5)

2.10 样品含有量测定丸剂按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样测定，计算含有量。分别采用肉桂醛、6-姜酚和吴茱萸碱标准曲线进行定量分析浓度平均分别为80.4 μg/ml、1973.2 ng/ml、22.1 ng/ml，换算含量后即平均每毫克药丸中含有1.9 μg肉桂醛，47.5 ng 6-姜酚，0.53 ng吴茱萸碱。见图12。

注：(d)总离子流图：1～3分别为肉桂醛、6-姜酚和吴茱萸碱

3 讨论

阴阳攻积丸整方以皂角煎液水泛为丸, 生姜汤送服，皂角180 g为最大剂量药物，应为君药；温热药物吴茱萸、干姜、肉桂、川乌各30 g均为臣药，具有“益火之源，以消阴翳”之意，可以祛寒化痰。《类证治裁》卷三指明该方主治五积六聚，七癥八瘕，痃癖皆效，现代医学的肿瘤多归属于此类疾病，但现代药效学研究尚未见报道。

现代医学中超过一半的抗癌化疗药来源于天然产物及其衍生物，因此中药的抗癌成分值得关注。TOF MS-IDA-TOF MS/MS共测得阴阳攻积丸中含有52种成分。其中的吴茱萸碱既往文献报道具有多靶点抗肿瘤增殖的功效，包括了肺癌、肝癌、白血病等共19种癌症，吴茱萸碱的抗癌作用与抑制细胞周期、增殖、侵袭和血管生成以及凋亡有关[4]。Yang等[5]报道吴茱萸碱通过降低磷酸化-Akt水平，升高凋亡蛋白Bax及裂解的caspase-3 和 PARP 多聚酶水平，抑制HepG2细胞增殖和细胞周期。吴茱萸碱的抗肝癌活性还与其激活含WW结构域的氧化还原酶有关[6]。另外，吴茱萸碱和小檗碱可协同作用诱导 SMMC-7721肝癌细胞死亡[7]。阴阳攻积丸配方中有吴茱萸和黄连，采用高分辨质谱可检测到吴茱萸碱和小檗碱成分，可能是其抗肝癌的成分组合之一。吴茱萸碱溶于丙酮，略微溶于乙醇、乙醚及氯仿，几乎不溶于水，低水溶性限制了应用，因此也开发了更多的衍生物及制剂，如纳米包封的吴茱萸碱[8]等等。Wu等[9]研究显示肉桂醛可通过ROS介导的细胞色素C释放和caspase-3激活诱导人PLC/PRF/5肝癌细胞凋亡。肉桂醛的衍生物BCA可促进脾细胞产生，增强刀豆蛋白刺激的脾细胞增殖，诱导淋巴细胞进入肝脏，最终抑制动物模型的肝癌进展[10]，而在HepG2细胞株，肉桂醛通过激活p53和CD95信号通路诱导细胞凋亡[11]。6-姜酚可改变肿瘤内血管网的分形几何特征，降低微血管结构熵，促进肿瘤微血管网络结构正常化，并因此显著增强化疗药顺铂药效，降低其不良作用，可能是温里药的抗肿瘤作用机制之一[12]。

综上，可以看出温里药与清热解毒药同样具有抗癌疗效。吴茱萸碱、肉桂醛、6-姜酚可能是阴阳攻积丸发挥抗癌疗效的重要成分。《中药大辞典》记载皂角辛，温，微毒, 功能主治祛风痰，除湿毒杀虫,含抗肿瘤化学成分三萜皂甙-皂荚皂甙B-G(gleditsiasaaponin B-G)，但本课题组未能搜索到国内外有此成分对照品出售,故未能检测。高效液相可检测到3种臣药成分吴茱萸碱、肉桂醛和6-姜酚，具有较好稳定性、重复性、精密度，但吴茱萸碱回收控制率相对较低，可进一步探索其检测方法。