重度中暑猪早期胰岛功能的变化

乔泽渊 倪 军 张 静 谢国旗

1.新乡医学院研究生处，河南新乡 453000；2.陆军第八十三集团军医院血液内分泌科，河南新乡 453000

人们在高温高湿环境作业时极易发生中暑，临床依据患者的临床症状将中暑分为轻度中暑（先兆中暑）、中度中暑（热衰竭）、重度中暑（热射病）[1]。胰岛素是重要的糖代谢调节激素，由胰岛β 细胞分泌，是体内唯一降血糖的激素，主要在肝脏被胰岛素酶灭活，也有少量在肾脏和肌肉中被灭活[2]。重度中暑早期机体需要增加皮肤血流量来散热，血液从内脏血管网向皮肤血管重新分布，缺血、缺氧加上热应激，导致胰岛、肝、肾组织损伤，影响胰岛素稳态[3-5]。重度中暑患者胰岛状态及胰岛素的分泌水平对其早期糖代谢有重要影响。本研究通过构建猪重度中暑模型，分析重度中暑猪早期血糖变化特点及其可能机制，以期为临床重度中暑早期糖代谢干预提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康CV 级雄性巴马小型猪12 只，体重10～15 kg，购自泰州泰和生物科技有限公司动物实验中心，动物许可证号：SCXK（苏）2017-0010。本研究经陆军第八十三集团军医院（以下简称“我院”）实验动物伦理委员会审核批准且遵循实验动物管理原则。所有实验动物正常体温范围为38～39℃，均抽取血样进行常规检测，检验结果显示其血细胞计数、凝血功能、肝肾功能、心肌酶水平均在正常范围[6-9]。分笼饲养于我院清洁动物实验室内，室内温度为（23±1）℃，湿度为（50±5）%，适应性喂养1 周。

1.2 主要试剂与仪器

盐酸艾司氯胺酮注射液（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：200325BL）；猪胰岛素酶联免疫吸附试验试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，货号：CSBE06828p）；猪胰岛素免疫组织化学（immuno histo chemistry，IHC）一抗试剂盒（中国Affinity Biosciences公司，货号：AF5109）；兔二步法二抗试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：PV-6001）；苏木精-伊红（hematoxylin-exosin，HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号：G1120）。恒温恒湿气候舱（广州富宸电器有限公司，型号：改良型F800-Z）；贝克曼生化分析仪（美国贝克曼库尔特有限公司，型号：AU5800）；高灵敏度电子体温计（湖南省瑞博科技有限公司，型号：PM-9000A）；酶标定量测定仪（德国Thermo 公司，型号：Fluoroskan）。

1.3 分组及模型制备

将12 只巴马小型猪按照随机数字表法分为对照组与模型组，每组6 只。两组实验前禁食、水12 h，实验前0.5 h 内测量3 次核心温度，取均值作为基础体温。对照组置于室温下，不做任何处理，模型组连接多参数心电监护仪，待生命体征平稳后，置于预热的恒温恒湿气候舱中，保持在44～47℃，相对湿度（65±5）%。两组核心温度由可重复使用的高灵敏热电偶探头进行监测，电偶探头的校准温度为0～50℃，将电偶探头置于肛内，每0.5 小时监测一次核心温度，记录一般表现，模型组核心温度＞42℃时终止实验，采集两组股静脉血送检血糖、胰岛素，耳后静脉注射盐酸艾司氯胺酮注射液20 mg/kg 进行麻醉后，固定于清洁动物解剖实验台，备皮、消毒，无菌操作下逐层打开腹腔，取胰腺、肾、肝组织样本进行后续检测。

1.4 观察指标及检测方法

股静脉采血5 ml，用全自动生物化学分析仪检测两组血糖水平。另取股静脉采血5 ml，用恒温离心机1000 g 离心20 min 取上清液（有效离心半径10 cm），严格按照试剂盒说明书步骤进行操作，计算两组血液中胰岛素水平。无菌操作下取胰腺、肝、肾组织标本，生理盐水冲洗后立即用10%中性甲醛固定48 h，石蜡包埋后制备组织切片，片厚2.5 μm，HE 染色，光学显微镜下观察其形态改变。

取同一部位胰腺组织用10%中性甲醛固定保存，常规行乙醇脱水、透明、石蜡包埋，切片2.5 μm。经烤片、脱蜡和水化、抗原修复、阻断、封闭、一抗孵育（一抗按1∶100 比例用含3%非免疫血清的磷酸盐缓冲液稀释，4℃孵育过夜，后于37℃孵育1 h 复温，用磷酸盐缓冲液冲洗3 次，每次5 min）、二抗孵育（滴加二抗，室温孵育60 min，后磷酸盐缓冲液漂洗3 次，每次5 min），显色，复染，封片后，应用Image-Pro Plus 6.0软件分析两组胰岛中胰岛素的平均光密度值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般情况及核心温度

模型组进入恒温恒湿气候舱后，核心体温呈升高趋势，对照组核心温度无变化，见图1。模型组核心温度＞42℃时出现精神萎靡不振，步态不稳，结膜充血，角膜反射减弱或消失，对照组无异常表现。

图1 两组核心温度变化

2.2 两组实验前后血糖及血液中胰岛素水平比较

实验前两组血糖及血液中胰岛素水平比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。对照组实验前后血糖及血液中胰岛素水平比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。实验后，模型组血糖水平高于实验前，血液中胰岛素水平低于实验前，且模型组血糖水平高于对照组，血液中胰岛素水平低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 两组实验前后血糖及血液中胰岛素水平比较（）

表1 两组实验前后血糖及血液中胰岛素水平比较（）

2.3 两组胰岛、肝、肾组织改变

对照组胰岛、肝、肾组织无明显改变；模型组胰腺组织中胰岛边缘不清，形态不规则，细胞水肿，少量粒细胞浸润，毛细血管瘀血；肾小管与集合管扩张，血管内可见血栓形成，上皮细胞颗粒变性，少量炎症细胞浸润；肝小叶结构紊乱，肝窦轻度瘀血扩张，肝细胞轻度水肿、颗粒变性，见淋巴细胞浸润。见图2～4。

图2 两组胰腺组织形态（HE，400×）

2.4 两组胰岛中胰岛素的表达比较

对照组观察到数量较多、呈棕黄色的胰岛素阳性表达，细胞排列紧密均匀，形态完整；模型组观察到胰岛着色区域少，形态不规则，见图5（封三）。模型组胰岛中胰岛素平均光密度值低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图6。

图3 两组肾组织形态（HE，200×）

图4 两组肝组织形态（HE，400×）

图5 两组胰腺组织中胰岛素表达（IHC，400×）

图6 两组胰岛中胰岛素水平比较

3 讨论

随着全球气候变暖，重度中暑患者死亡率可达10%～30%[10]。有研究表明重度中暑患者早期血糖异常升高[11-12]，异常升高的血糖可引起非特异性炎症反应，导致组织损伤和器官衰竭，影响患者的预后[13-15]。重度中暑导致糖代谢紊乱，可能是由于胰腺、肝脏、肠道、肾脏、肌肉等不同程度的功能和器质损伤，影响了血糖调节的过程，其中胰腺对热损伤较为敏感[16-17]。有研究观察到胰腺在中暑时易受缺血、缺氧影响，胰岛素分泌功能紊乱[18-19]。

本研究分析和总结国内外近年构建重度中暑实验动物模型的相关文献[20-22]，制订大型动物猪的重度中暑标准如下：①出现明显的行为异常，如烦躁不安、站立不稳等；②核心温度＞42℃；③出现生理反射异常，如角膜反射、提肛反射减弱或消失等。本研究将巴马小型猪置于恒温恒湿气候舱（模拟高温高湿环境）中，当热暴露时间为4 h 左右时，模型组呼吸、心率加快，出现步态不稳、全身大汗及结膜充血、角膜反射减弱或消失等，测量核心体温＞42℃，认为造模成功。由于经济实用易重复，国内多采用大鼠作为实验动物，但小型动物的体型限制了部分临床干预手段的实施，而且其生理代谢与人类有较大差异。国外部分学者以狒狒作为实验动物，但其价格昂贵且不宜获取，实际操作中难以推广[23]。小型猪在糖代谢、胰岛的发育形态等方面与人类相近，而且温顺、繁殖力强、基因稳定，相较于小型动物大鼠等具有显著的优势[24]。

本研究观察到模型组胰岛、肝、肾组织出现一定损伤，免疫组化染色进一步观察到胰岛素染色平均光密度值降低，提示其胰岛细胞分泌胰岛素功能受损。王超等[25]研究发现热应激小鼠的血浆胰岛素水平降低，认为热损伤对小鼠糖代谢有一定的抑制作用；李延森等[26]研究观察到热应激抑制雄性巴马香猪胰岛素分泌，血糖水平升高；袁雄坤等[27]研究认为母猪中暑早期血糖水平升高，随着热应激时间延长，会出现血糖水平降低；刘圈炜等[28]研究认为持续热应激状态下，猪血糖水平开始时升高，之后下降，最后又有所升高。以上研究与本研究结果基本一致，提示猪重度中暑早期出现血糖升高，可能不单是胰岛素水平的变化，肝肾组织损伤也可能加重了糖代谢紊乱的趋势，还需要进一步的深入研究。

综上所述，猪重度中暑早期出现糖代谢紊乱。本研究不足之处在于没有动态连续观察猪发生重度中暑后血糖及胰岛素水平的变化，实验结论有一定的局限性，在后续的实验研究中给予补充完善。