KIF20A在高级别T1膀胱癌组织中的表达及其预测术后复发的价值

任伟刚 李嘉辉 李铁求 谭武宾 周松

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，临床上主要以手术为主，并辅之以化疗等综合治疗手段，但是患者预后普遍较差，术后高复发率是主要原因［1］。高级别 T1（T1 high-grade，T1HG）膀胱癌属于高危非肌层浸润性膀胱癌，恶性化程度和复发率均较高，患者预后更差［2］。在T1HG膀胱癌患者治疗中，对于根治性膀胱切除术和保留膀胱的选择仍存有较大争议［3］。因此，寻找生物标志物准确地预测术后复发风险，对制定治疗策略及筛选高危患者具有重要的临床价值。驱动蛋白 20A（kinesin family member 20A，KIF20A）作为一类具有轴突运输功能的分子马达，通过与鸟苷三磷酸（GTP）结合的Rab6相互作用，参与细胞器和囊泡的细胞内运动、纺锤体形成和胞质分裂等细胞有丝分裂进程［4］。研究发现，KIF20A在脑胶质瘤、胰腺癌等组织中高表达，具有一定的促癌因子活性［5-6］，SHEN等［7］基于细胞实验发现，KIF20A能促进膀胱癌细胞增殖和转移。本研究结合生物信息学分析及临床样本，探讨T1HG膀胱癌组织中KIF20A的表达及其预测术后复发的价值，以进一步明确KIF20A在膀胱癌中的作用。

1 资料与方法

1.1 生物信息学分析

从癌症基因图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库（https：//cancergenome.nih.gov/）中收集404例膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA）患者的RNA-Seq转录组数据和相应的临床病理和预后信息。根据中位数将患者分为KIF20A高表达组和低表达组。使用在线工具基因表达谱互动分析服务器（GEPIA）（http：//gepia.cancer-pku.cn/）分析 KIF20A 表达与预后的相关性。

1.2 临床资料

收集2013年8月—2015年12月本院泌尿外科收治的94例原发性T1HG膀胱癌患者的癌组织及其癌旁组织标本（距肿瘤边缘≥3 cm）。患者纳入标准：⑴病理学诊断为原发性T1HG膀胱癌；⑵首次行经尿道膀胱肿瘤电切术（transurethral resection of bladder tu-mor，TURBT）；⑶术后4～6周内再次接受TURBT术，且最大限度地切除残留肿瘤；⑷术前未接受化疗、放疗、靶向治疗等抗肿瘤治疗，无电切术或膀胱灌注化疗史；⑸临床、病理和随访数据资料完整。排除标准：⑴转移性/继发性膀胱癌患者；⑵急性炎症患者；⑶未接受手术治疗的患者。采用1973年膀胱癌分级标准（1～3级）［8］，根据《中国泌尿外科疾病诊治指南》［3］诊断标准评估患者的T分期和肿瘤分级。所有患者均接受TURBT术，且术后24 h内进行膀胱灌注化疗，灌注药物包括表柔比星、吡柔比星、羟基喜树碱和吉西他滨。本研究分析方法根据我院生物处置室的核准规定进行，且符合赫尔辛基宣言和伦理道德行为中概述的原则。本研究方案经本院伦理审查委员会批准以及患者知情同意。

1.3 免疫组化法检测膀胱癌组织KIF20A蛋白表达

从福尔马林固定的石蜡包埋块上连续切取约4 μm组织切片，在二甲苯中浸泡，在分级乙醇溶液中重新水化，用蒸馏水洗涤5 min，然后固定在聚赖氨酸涂层玻片上。在95℃10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）中对已脱蜡和再水化的载玻片进行抗原恢复，然后用3% H2O2破坏内源性过氧化物酶活性。用5%胎牛血清封闭非特异性结合位点。切片与初级抗体（特异性单克隆抗体KIF20A）在4℃条件下孵育过夜。用DAB染色试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］检测免疫反应。所有载玻片均由2名病理科医师盲法阅片。黄色或棕色染色细胞视为阳性染色细胞。用光学显微镜计数细胞，并计算5个随机场中阳性细胞的平均百分比，阳性细胞百分比<25%定义为KIF20A阴性表达，阳性细胞百分比≥25%定义为KIF20A阳性表达［9］。

1.4 随访与研究结局

自TURBT术后次日开始随访，通过门诊或电话方式开展，随访截至2021年5月。前2年每3个月进行尿细胞学和膀胱镜检查，第3年每6个月复查1次，之后每年复查1次。中位随访时间为32.0个月（范围：7～89个月）。主要研究终点为疾病复发，定义为TURBT术后出现任何病变（包括非肌层浸润和进展为肌层浸润）的病理证据，无复发生存时间定义为术后到肿瘤复发的时间。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行数据分析，连续变量采用均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验。分类变量以n（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用单因素和多因素Cox比例风险回归分析术后复发的因素。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存曲线组间比较采用log-rank检验。以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学分析

生物信息学分析显示，大多数类型肿瘤组织（除急性髓细胞样白血病外）中KIF20A mRNA的表达均高于相对应正常组织，见图1A；与正常膀胱组织（n=28）相比，膀胱癌组织（n=404）KIF20A mRNA表达量显著升高（P<0.05），见图 1B；KIF20A mRNA高表达组膀胱癌患者的无疾病进展生存率明显低于低表达组（P=0.012），见图1C。

图1 肿瘤组织和正常组织中KIF20A转录本表达差异数据（资料来源：http://gepia.cancer-pku.cn/）Fig.1 Difference of KIF20A transcript expressions between tumor tissues and normal tissues(Source:http://gepia.cancer-pku.cn/)

2.2 膀胱癌组织中KIF20A蛋白的表达情况

免疫组化检测结果显示，KIF20A主要表达在细胞质和细胞膜上，偶见细胞核染色。与癌旁组织相比，T1HG膀胱癌组织中KIF20A蛋白阳性表达率升高（12.8%vs64.9%，χ2=53.769，P<0.001）。见图2。

图2 膀胱癌组织和癌旁组织中KIF20A蛋白的免疫组化染色结果(×200)Fig.2 Immunohistochemical staining results of KIF20A protein in bladder cancer and adjacent tissues(×200)

2.3 KIF20A蛋白表达与T1HG膀胱癌患者临床病理特征的关系

KIF20A蛋白表达水平与T1HG膀胱癌患者年龄、吸烟史、肿瘤直径、T1亚分期、病理分级有关（均P<0.05）；未发现KIF20A蛋白表达与性别、肿瘤数目、淋巴管浸润等有关（均P>0.05）。复发患者KIF20A蛋白阳性表达率高于未复发患者（P<0.05）。见表1。

表1 KIF20A蛋白表达水平与T1HG膀胱癌患者临床病理特征的关系［n（%）］Tab.1 Relationship between the expression of KIF20A protein and clinicopathological features of patients with T1HG bladder cancer［n(%)］

2.4 KIF20A蛋白表达与T1HG膀胱癌患者复发的关系

随访截至2021年5月20日，无失访病例。KIF2A蛋白阴性表达组和阳性表达组1年、3年、5年无复发生存率分别为96.97%、86.89%、75.76%和31.15%、69.70%、29.51%。Log-rank检验显示，两组患者术后无复发生存率差异有统计学意义（log-rankχ2=16.154，P<0.001）。见图3。

图3 KIF20A蛋白表达与T1HG膀胱癌患者术后复发的关系Fig.3 Relationship between KIF20A protein expression and the recurrence of T1HG bladder cancer patients

2.5 Cox比例风险回归分析影响T1HG膀胱癌患者复发的因素

多因素Cox比例风险回归显示，多发肿瘤、肿瘤直径>3 cm、T1c分期、G3分级以及KIF20A蛋白阳性表达是膀胱癌患者术后复发的独立危险因素（均P<0.05），见表2。

表2 Cox回归分析影响T1HG膀胱癌患者术后复发的因素Tab.2 Cox regression analysis of clinical factors affecting the postoperative recurrence of T1HG bladder cancer patients

3 讨论

T1HG膀胱癌具有浸润性癌的生物学特点，术后复发率较高，因此有效进行复发预测对其临床治疗决策具有重要意义［10］。目前，众多学者也对此进行不断探索，其中部分临床和病理预后因素在荟萃分析中显示出一定特异性，但是准确性有限，仍未能常规用于临床［11］。KIF家族分子具有高度保守的动力学域，其家族成员大多具有ATP活性，并能够向微管的正极移动，可参与多种生理功能，如细胞内纺锤体形成、染色体分配和物质运输［4］。KIF20A（也被称为MKLP2和RAB6KIFL）是激酶家族的重要成员之一，位于染色体5q31.2上，编码的蛋白质含有890个氨基酸，分子量约为100 kDa［12］。有丝分裂运动蛋白是细胞分裂过程中纺锤体组装和染色体分离的关键，KIF20A被认为是肌动蛋白和微管细胞骨架耦合所必需的一种运动蛋白［13］。此外，KIF20A具有微管依赖的正端运动，因此参与了不同的细胞过程，且其主要聚集在有丝分裂细胞梭形的中央区域，在细胞分裂后期和纺锤体中央组织中发挥重要作用［14］。近年来，研究发现KIF20A与乳腺癌［15］、胃癌［16］、胰腺癌［17］等多种肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移有关。此外，SHENG等［18］发现KIF20A下调可诱导胃癌细胞有丝分裂（G2/M期）阻滞，增强化疗药物敏感性。在膀胱癌中，SHEN等［7］通过质粒转染方式敲低膀胱癌细胞株T24KIF20A基因表达后，细胞增殖和侵袭活性被显著抑制。上述这些研究证实KIF20A表达上调与肿瘤细胞癌变过程和恶性化进展相关。

本研究首先通过生物信息学分析KIF20A表达情况，结果显示，与癌旁组织相比，膀胱癌组织KIF20A mRNA表达量升高，且无疾病进展生存率更低。在临床样本中检测KIF20A表达情况同样发现相似结果，同时发现KIF20A蛋白表达与恶性表型有关，阳性表达患者表现为年龄更大、有吸烟史、肿瘤直径更大、T1亚分期更晚、病理分级程度更差。此外，多因素分析也发现KIF20A蛋白阳性表达是膀胱癌患者术后复发的独立危险因素，提示KIF20A可能参与了膀胱癌的发生和进展，KIF20A有望成为膀胱癌患者预后的独立危险因素和治疗的潜在靶点，而KIF20A促癌基因的活性可能是其促进T1HG膀胱癌患者术后复发的关键机制，值得进一步研究证实。