鸡粪好氧堆肥腐熟度、重金属残留及微生物菌群分析

王秀红，史向远，张纪涛，王豫霞，李欣欣，周 静，赵红叶

（1.山西农业大学山西有机旱作农业研究院，山西太原 030031；2.山西省农业科学院现代农业研究中心，山西太原 030031；3.太谷县鸿昊养殖专业合作社，山西太谷 030800）

随着禽类养殖的规模化、集约化和产业化的快速发展，我国每年畜禽粪便的产生量大约有38 亿t，其中，肉蛋鸡粪便占到16.3%，约有6.2 亿t[1-3]。由于畜禽粪污产生集中，而且排放量较大，再加上粪污处理的设施装备落后，农田消纳跟不上，这些因素成为制约畜禽养殖产业可持续发展的重要瓶颈[4]。鸡的肠道较短，消化饲料的能力弱于其他畜种，排出的鸡粪一旦暴露到空气中即易形成NH3等恶臭气体。为了防治疾病或促进畜禽生长，一些重金属元素如Cu、Zn、As、Cd 和Pb 等会通过饲料或以伴生矿的形式进入畜禽体内，由于这些元素不能完全被吸收且化学性质稳定，最后随粪便排出体外[5-6]。此类有害气体、重金属和鸡粪中存在的病原微生物不仅对环境造成污染而且危害到人体健康，成为我国主要的农业面源污染[7-8]。鸡粪中含有农作物生长所必需的氮、磷、钾等营养元素和丰富的有机质，是很好的有机肥源[9]。如何高效快捷地对鸡粪进行无害化处理并得到资源化利用，已成为当今农业领域需要解决的热点问题。

当前，好氧堆肥技术是实现鸡粪减量化、无害化和资源化的有效手段。好氧堆肥可以固化重金属、抗生素、杀死虫卵和多种病原微生物，从而获得稳定、安全的堆肥产品，再进一步加工成有机肥施入农田，可改善土壤结构，提高土壤肥力[10-13]。在实际的生产应用中，鸡粪堆肥常出现腐熟不彻底，施入土壤后烧苗和长霉菌现象，有必要对有机肥厂的好氧堆肥过程进行监测，以确保堆肥效果。微生物群落的演替是堆肥过程顺利进行的反应[14]，利用高通量测序技术研究鸡粪堆肥发酵中微生物群落多样性，可深入了解好氧发酵堆肥不同阶段的菌群组成结构及其演替过程[15]。

本研究通过对鸡粪条垛堆的发酵过程进行监测，研究养殖场条垛式堆肥的腐熟度效果及对重金属含量的影响，并对堆体内微生物的丰度变化进行分析，以期为养殖场有机肥生产初期堆肥产品的腐熟度及安全性提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

鸡粪、烟丝和糠醛均由太谷县鸿昊养殖专业合作社提供和购买。堆肥原料的基本理化性质如表1所示。

表1 堆肥原料的基本理化性质

1.2 试验设计

试验在太谷县鸿昊养殖专业合作社养殖场的发酵车间进行。以固液分离后的鸡粪为主要原料，烟丝、糠醛为辅料进行条垛式好氧堆肥。堆体大小为长20.0 m、宽1.5 m、高1.35 m，设置2 次堆肥试验，分别记为堆1 和堆2，在堆制第0、8、18、21、28、33、38、45、60 天堆温升高欲降低时利用翻抛机翻堆，混合取样，部分样品冷藏或自然风干用于腐熟度及其他理化指标测定；部分样品保存于-20 ℃冰箱用于高通量测序。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 理化指标测定 采用RC-4HC 型便携式温湿度记录仪实时监测定堆体内40 cm 深度处温度，每1.5 h 记录一次；测试样品物料于105 ℃的烘箱中烘干8 h 至恒质量，测定含水率。采用马弗炉高温灼烧（600 ℃）4 h 至恒质量测定有机质含量。利用TOC 仪测定总有机碳，凯氏定氮仪测定总氮。

将新鲜堆肥样品与蒸馏水按1∶10（m/V）混合于三角瓶中，于水平摇床上振荡30 min，静置10 min，上清经滤纸过滤后收集，用便携式pH/电导率仪测定pH 和EC[16-18]。发芽指数（GI）的测定方法参照NY/T3442—2019 标准进行。重金属含量采用原子吸收法测定[10]。

1.3.2 高通量测序 细菌和真菌的基因组DNA 参照OMEGA 试剂盒方法进行提取。细菌PCR 所用测序引物为16S V3～V4 通用引物，正向引物：5′-ACTC CTACGGGAGGCAGCA-3′，反向引物：5′-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3′。真菌PCR 所用引物为ITS V1 引物，正向引物：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAAC AAGG-3′，反向引物：5′-GCTGCGTTCTTCATCGAT GC-3′。PCR 扩增条件：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性15 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，26 个循环；最后72 ℃延伸5 min；12 ℃结束反应。采用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。高通量测序采用Illumina Miseq 测序平台进行。

1.4 数据分析

测序数据经DADA 2 方法进行去引物，质量过滤，去重、去噪，拼接和去嵌合体等，得到特征序列。用QIIME 2 软件分别在Greengenes 数据库和UNITE数据库对特征序列进行物种分类学注释，获得在门、纲、目、科、属、种6 个分类水平上的物种丰度情况。采用Microsoft Excel 2007 进行基本数据整理，用SPSS 20.0 软件进行方差分析，并采用Duncan 多重比较进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 堆体温度的变化

温度是表征畜禽粪便堆肥能否正常进行的关键因素之一。在-14～4 ℃的环境温度下，2 种堆体均进行了8 次翻堆。堆1 建堆后温度开始上升，第4 天达到40 ℃以上，第8 天达到50 ℃以上，经过第1 次翻堆后，堆体温度上升至56.9 ℃，第2 次和第3 次翻堆均在40～50 ℃，在第4 次翻堆后，即第22 天温度上升至55 ℃以上，到发酵第60 天堆肥结束，堆体55 ℃以上温度持续时间为37 d。堆2 在第1 天温度上升至45 ℃，第2 天达50 ℃以上，第3 天即上升至55 ℃，第4 天为59.9 ℃，第1 次翻堆后，堆体温度在40～50 ℃，第2 次翻堆后温度很快上升至55 ℃以上，到第4 次翻堆后达到71.2 ℃，除了堆体因翻堆温度计记录温度有所下降外，堆体在55 ℃以上持续时间第1 次为12 d，第2 次为27 d（图1）。说明2 种堆体在环境温度为白天0～19 ℃、夜间-14～1 ℃的条件下完全能够达到无害化和稳定化的要求。

2.2 不同发酵阶段堆体腐熟度变化

从表2 可以看出，经过条垛堆体的晾晒发酵，堆体含水率下降差异显著，堆1 和堆2 的含水率在第33 天分别下降至42.12%和41.79%；第60 天后则分别下降至34.00%和39.73%。pH 值呈现显著性上升趋势，2 个堆体在第33 天均达到最高值，分别为9.07 和8.77；堆制结束时，2 个堆体的pH 值分别为8.70 和8.51，堆体由最初的酸性环境变成碱性环境。初始堆体的EC 值均较高，堆1 和堆2 的EC 值分别达到9.75、9.26 mS/cm；到第33 天时，2 个堆体的EC 值显著下降，分别为6.66、5.78 mS/cm；第60 天分别为7.30、6.06 mS/cm，下降了25.13%和34.56%。随着发酵时间的延长，堆1 和堆2 的有机质含量显著下降，堆制结束时分别下降了21.37%和16.83%。鸡粪堆肥初始物料的发芽指数很低，堆1 和堆2 分别为4.22%和5.06%；到第21 天2 个堆体的发芽指数均显著上升，分别达到44.42%和40.58%；在堆制结束时，分别达到了86.57%和111.91%。

表2 不同堆肥阶段堆料腐熟度分析

2.3 不同阶段堆料中重金属含量变化

对堆1 不同发酵阶段的堆料进行了重金属检测，不同种类重金属的含量差异较大。由表3 可知，堆体中砷（As）、铅（Pb）和铬（Cr）的含量较高，分别为1.22～4.92、3.50～12.08、7.53～23.67 mg/kg，汞（Hg）和镉（Cd）的含量较低，分别为0.02～0.20、0.09～0.13 mg/kg。在第33 天，与初始物料相比，堆料的Cd 含量无显著差异，As、Pb 和Cr 含量显著提高，Hg 含量显著下降。发酵结束时，Hg 含量上升，As、Pb 和Cr 含量均下降。熟化后堆肥除Cd 外，其他重金属含量均显著提高，As、Hg、Pb 和Cr 含量分别比发酵结束时提高了1.02 倍、4.00 倍、1.52 倍和0.93 倍。

表3 不同发酵阶段堆料重金属含量变化 mg/kg

2.4 鸡粪堆肥中微生物菌群表达丰度分析

从图2 可以看出，鸡粪好氧堆肥期间相对表达丰度高于0.01%的真菌门类有6 个，表达丰度较高的4 个门为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、毛霉菌门（Mucoromycota）和油壶菌门（Olpidiomycota）。子囊菌门在整个堆肥阶段均维持较高的表达丰度，达80.5%～95.7%，担子菌门、毛霉菌门和油壶菌门的相对表达丰度分别为0.04%～2.70%、0.03%～2.90%和0～1.90%。球囊菌门（Mortierellomycota）和罗兹菌门（Rozellomycota）仅是在发酵的初期和末期有较低的表达。在真菌属水平上，相对表达丰度较高的属为念珠菌属（Candida）、毕赤酵母属（Pichia）、链格孢菌属（Alternaria）、曲霉属（Aspergillus）、Diutina、干酵母属（Xeromyces）、Sodiomyces。在建堆初期，念珠菌属、毕赤酵母属、曲霉属丰度较高，堆制8 d 后则念珠菌属丰度上升；堆制21 d 后，则以链格孢菌属丰度较高；33 d 后，毕赤酵母属、Diutina 和Xeromyces 较高；第60 天则以子囊菌门的链格孢菌属和Sodiomyces 表达丰度最为丰富，其余菌属均较初期降低，真菌病原微生物念珠菌属表达丰度明显下降，由第8 天的66.9%下降至5.5%。

由图3 可知，不同阶段鸡粪堆肥中，相对表达丰度较高的细菌门类为厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）。拟杆菌门在第33、60 天中表达丰度较高。建堆初期，厚壁菌门表达丰度达97%，到堆制8 d 后，厚壁菌门为19.4%，放线菌门的丰度显著升高，达到78.5%；堆置21 d 后厚壁菌门丰度增加（88.8%），放线菌门减少（0.2%），拟杆菌门和变形菌门在堆肥结束时表达丰度均有增加；在培养第33、60 天后，4 种门类丰度均高于1%。在整个发酵过程中，厚壁菌门起初丰度最高，发酵8 d后降低，发酵21 d 后上升，在第33、60 天时均有较高丰度。拟杆菌门则是在堆肥后期有较高丰度。放线菌门在第8 天丰度急剧上升，在后期丰度保持在较高丰度。变形菌门是在前期较低，后期丰度上升。4 种菌门在后期及有机肥阶段均有较高的丰度。在属水平上，整个发酵期相对表达丰度较高的属为棒状杆菌属（Corynebacterium）、梭菌属（Clostridium）、Caldicoprobacter、依格纳季氏菌属（Ignatzschineria）、芽孢杆菌属（Bacillus）、薄壁芽孢杆菌属（Gracilibacillus）、Sporanaerobacter、食碱菌属（Alcanivorax）、粪产碱菌属（Alcaligenes）。在建堆初期，以厚壁菌门的梭菌属和Caldicoprobacter 的丰度较高，堆制8 d 后则以放线菌门的棒状杆菌属、厚壁菌门的梭菌属和芽孢杆菌属较高；堆制21 d 后，则以变形菌门的依格纳季氏菌属、厚壁菌门的芽孢杆菌属和Tepidimicrobium 丰度较高；33 d 后，以厚壁菌门的芽孢杆菌属和薄壁芽孢杆菌属较高；成品有机肥则以芽孢杆菌属和薄壁芽孢杆菌属、变形菌门的食碱菌属和粪产碱菌属较高。

3 结论与讨论

新鲜畜禽粪便中含有一些危害作物生长的物质，如尿酸、有机酸、氨态氮、虫卵、病原菌和重金属等[19]，因此，畜禽粪便必须经过堆肥腐熟后才可用作有机肥，无害化和稳定性是鸡粪堆肥的主要目标。本研究中堆体55 ℃以上高温持续时间均高于15 d，达到了无害化要求。堆料含水率在发酵结束时，堆料含水率下降明显，均小于45%。微生物在鸡粪堆肥过程中将蛋白质等含氮物质降解产生NH4+，引起pH 值的升高，堆体处于一个碱性环境。本研究中，2 种堆体的pH 起初均呈酸性，随着堆制时间延长，堆体pH 值上升，到堆制60 d 时，堆体pH 值在8～9[20]，满足堆肥产品为弱碱性的要求。EC 是评价堆肥产品的重要指标之一[21]。当EC 高于4 mS/cm时，堆肥产品会对植物生长产生抑制作用。鸡粪中含盐量高，经过好氧堆肥，尽管堆体的EC 值分别下降了25.13%和34.56%，但对于田间使用来说，本研究中的EC 值均大于4 mS/cm，仍处于一个较高的水平。堆肥原料中的EC 对堆料结果影响较大，鸡粪、烟丝、糠醛的粒径细小，堆体结构比较致密，导致堆肥产品EC 偏高，这一结果与张邦喜等[22]的结果相一致。通过好氧堆肥，堆料的有机质含量呈下降趋势，第60 天时有机质含量在60%以上。种子发芽指数（GI）也是评价堆肥腐熟程度的重要指标，未腐熟的畜禽粪便施入土壤中，会对农田种子发芽和作物生长有毒害作用，所以，GI 是有机肥利用中首要考虑的因素，当GI 超过80%时，认为堆肥已经腐熟或对植物没有毒性[23-24]。鸡粪堆肥初始GI 很低，说明未腐熟过的鸡粪用于作物种植有很大的风险。本研究中，随着发酵的进行，GI 明显上升，说明堆体中不利于发芽的因素逐渐被消除，到堆肥60 d 后，GI 达到了80%以上，基本趋于稳定。重金属含量是影响有机肥的品质指标之一。邓雯文等[25]研究表明，As、Cd 和Pb 在发酵过程中存在先升高后下降的趋势。本研究中不同阶段的发酵物料其各项重金属含量也存在波动，腐熟后堆体重金属含量升高，这应该与好氧堆肥存在浓缩效应有关。YANG 等[26]研究表明，随之堆肥过程中有机质的降解和物质的挥发，物质总量不断减少，重金属含量相应升高。本研究中堆肥结束时，5 种重金属的含量均低于标准限制浓度，说明该鸡场鸡粪堆肥不存在重金属超标现象。由以上结果表明，2 种堆肥均达到畜禽粪便堆肥技术规范（NY/T 3442—2019）[27]要求。

本研究中鸡粪好氧堆肥期间相对表达丰度较高的真菌门类为子囊菌门，这与XIE 等[28]的研究结果一致。XIE 等[28]研究表明，念珠菌属、Trichosporon、Kodamaea 和Filabasidium 对人体和动物均有潜在的危害，不同堆肥处理的病原菌念珠菌属相对丰度随堆肥过程的进行而降低。本研究中念珠菌属在发酵初期表达丰度较高，到后3 次翻堆时，念珠菌属的表达大幅下降，由66.9%下降至5.5%。曲霉属、Malbranchea 和Mycothermus 在堆肥成熟阶段表达丰度较高，它们在高温好氧堆肥中可以降解纤维素和半纤维素[28]。本研究中，链格孢菌属、曲霉属在堆肥期间均有较高丰度，应该与降解大分子有机化合物有关。鸡粪堆肥的优势细菌门为厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门，这与ZHONG 等[29]的结果一致。本研究中成品有机肥的芽孢杆菌属和薄壁芽孢杆菌属、变形菌门的Alcanivorax 和粪产碱菌属较高。鸡粪中的主要细菌病原菌为大肠杆菌和沙门氏菌，它们分别属于变形菌门的埃希氏菌属和沙门氏菌属，在本研究中未检测到大肠杆菌和沙门氏菌。从真菌和细菌表达丰度的结果表明，鸡粪堆肥减少了部分病原菌的丰度。由于对畜禽粪污病原菌信息掌握不够，对于与病原菌相关的微生物种类及其表达丰度还有待进一步分析。