谷子粒黑穗病菌PCR 检测体系的建立

郝雅萍，焦思薇，郭二虎，仪慧兰

（1.山西农业大学农学院，山西太原 030031；2.山西大学生命科学学院，山西太原 030006；3.山西农业大学谷子研究所，山西长治 046000）

谷子（Setaria italica）是一种重要的禾本科作物，在我国有8 000 多年的栽培历史，属山西省优势杂粮作物。随着谷子种植面积的不断扩大，多种病害时有发生[1]，谷子黑穗病在我国的主要产区均有不同程度的发生，其中，谷子粒黑穗病是最常见的，其致病菌为粒黑穗病菌（Ustilago crameri）[2]。病菌孢子随谷种播种进入土壤，随后孢子萌发侵染幼苗，在植株体内蔓延，最终危害谷子穗部。被病菌侵染的籽粒因病原菌冬孢子大量形成变为黑粉，黑粉外包坚韧的灰白色膜，有一定机械强度。当谷子收获脱粒或经风吹摩擦时，籽粒破裂散出黑粉污染种子，来年随种子播种进入谷田。目前对谷子黑穗病的控制主要靠农药[3]，而抗病品种的使用才是解决问题的根本。

针对不同地域病原菌生理小种的差异[4]，对抗病品种的常规筛选主要是应用形态学鉴定，通过对相同种植条件下不同品种谷子植株的感病特性进行分析比较，由发病率和发病程度判断品种对病原菌小种的敏感或抗性[5-6]，该过程比较费时，不利于控制病害的传播。因此，寻找一种快速、灵敏、有效的方法来检测不同品种的抗病性是十分重要的。

近年来，研究人员应用PCR 技术检测植株组织中的病原菌DNA 来判断病原菌对植株的侵染特征，该过程操作简便、特异性强、快速、经济[7]。目前已建立了针对玉米和高粱的丝黑穗病[8-9]、小麦白粉病和散黑穗病[10-11]、甘蔗黑穗病[12]等的PCR 检测技术。用PCR 技术检测特定植物病原菌主要靠引物的有效性，引物设计用到的基因序列有：真菌核糖体脱氧核糖核酸（rDNA）及间隔区，如基因间区（Intergenic spacer，IGS）、核糖体基因内转录间隔区（Internal transcribed spacer，ITS）等[13-14]；未知的特异DNA 片段；保守的蛋白基因序列。但到目前为止，应用PCR 方法检测谷子粒黑穗病菌的研究未见报道。

本研究根据黑穗病菌ITS 序列设计PCR 引物，建立了谷子粒黑穗病菌的快速检测体系，并证明所用引物和PCR 检测体系在鉴定病菌感染和植株抗病性方面具有较高的特异性，可快速、准确地监测谷子粒黑穗病，并为提前预防谷子粒黑穗病提供特异性高、实用性强的技术支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

谷子粒黑穗病菌（Ustilago crameri）冬孢子、谷瘟病菌（Pyricularia setariae）菌丝，由山西农业大学谷子研究所郭二虎研究员提供；谷子白发病菌（Sclerospora graminicola）孢子、玉米黑粉菌孢子采自大田发病植株。

1.2 试验方法

1.2.1 材料准备 取谷子粒黑穗病菌冬孢子粉过0.297 mm 筛，用于谷种拌菌。选用对黑穗病抗性不同的谷子品种晋谷21 和长农35，设谷种拌菌组与不拌菌对照组，同期播种于山西农业大学谷子研究所试验田。每个处理播种3 个小区作为重复，每个小区面积30 m2，拌菌组与对照组间设置隔离带。在谷子拔节期与抽穗期，每小区随机选3 个样点，每个样点随机选取生长一致的5 株植株，采集拌菌组与对照组植株各5 株，带回实验室备用。

1.2.2 病原菌和谷子DNA 的提取 称取一定量的病原菌孢子粉或谷子叶片/穗梗于研钵中，加少许石英砂，加入CTAB 提取液[15-16]，充分研磨，匀浆液转入离心管中于65 ℃水浴50 min，10 000 r/min 离心10 min，取上清加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1（V/V）），10 000 r/min 离心10 min。取上清，加入RNase A，37 ℃水浴40 min。加入等体积的预冷异丙醇，12 000 r/min 离心15 min，沉淀用75%乙醇漂洗，溶于TE。用琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA分子的完整性，测OD260和OD280值检测提取物的浓度和纯度。

1.2.3 谷子粒黑穗病菌DNA 的序列分析 以真菌ITS 的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）为扩增引物，以谷子粒黑穗病菌DNA 为模板，进行PCR 扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检验合格后送华大基因有限公司测序，测序结果用Blast 进行分析，并用Clustal X，MEGA 5.0 获得系统发育树。

1.2.4 谷子粒黑穗病菌特异性引物设计 将菌株Ustilago avenae（登录号AY740062.1）、Ustilago hordei（登录号AY740068.1）、Ustilago maydis （登录号AY345004.1）、Ustilago nuda（登录号AY740069.1）的rDNA-ITS 序列与谷子黑穗病菌ITS 序列进行比对，选择与谷子黑穗病菌ITS 序列相似度高的菌株的ITS 序列，利用生物学软件Clustal X 进行比对分析，运用软件Primer Premier 5.0 设计谷子粒黑穗病菌特异性引物，其中，上游引物F1序列为5′-AGAC GGGTTTACCACTCAAC-3′，下游引物R1序列为5′-AAGCCACGGTGAATGGCAAAG-3′，由生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.5 引物特异性及灵敏度检测 分别以谷子黑穗病菌孢子、谷子白发病菌孢子、谷瘟病菌菌丝、玉米黑粉菌孢子及对照组谷子叶片的基因组DNA 作为PCR 扩增模板，用自行设计的谷子粒黑穗病菌ITS 引物进行PCR 扩增。扩增体系为20 μL，包括：10×Buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，引物各0.4 μL，DNA模板量0.4～1.0 μL，Taq 酶0.2 μL，余量用双蒸水补足。扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

将谷子粒黑穗病菌基因组DNA 浓度分别调整为100、10、1 ng/μL、100、10、1、0.1 pg/μL，作为PCR扩增模板，采用上述引物和条件进行PCR 扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.6 大田谷子植株粒黑穗病菌侵染性检测 以谷种拌菌组和不拌菌对照组谷子的旗叶和穗梗的基因组DNA 作为PCR 扩增模板，用谷子粒黑穗病菌ITS 引物进行PCR 扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，若出现特异性扩增条带则说明谷子特定组织被黑穗病菌侵染。

2 结果与分析

2.1 谷子粒黑穗病菌ITS 序列特征分析

将提取的谷子粒黑穗病菌冬孢子DNA 进行ITS-PCR 扩增，扩增产物测序结果在GeneBank 中进行Blast 检索分析，构建Neighbour Joining 分子发育树。结果显示（图1），粒黑穗病菌孢子ITS 序列长度在700 bp 左右，与GeneBank 数据库中的谷子粒黑穗病原菌（AY344999.1 Ustilago crameri）的序列同源性为95%，系统发育树中聚在一支。说明本研究从田间发病谷穗得到的病原菌为谷子粒黑穗病菌。

2.2 引物特异性与灵敏度检测

用自行设计的谷子粒黑穗病菌引物对不同供试样品基因组DNA 进行PCR 扩增，扩增产物电泳分析发现，仅谷子粒黑穗病菌基因组DNA 作模板时能扩增出1 条特异性条带，大小与目标片段（320 bp）基本一致，其他供试菌株及对照组谷子叶片没有扩增产物。结果表明，所设计的引物对谷子粒黑穗病菌具有特异性（图2）。

采用相同的扩增体系和扩增程序，测试粒黑穗病菌基因组DNA 模板量对扩增的影响，结果表明（图3），模板质量浓度为100、10、1 ng/μL 以及100、10 pg/μL时均可获得清晰的目标条带，模板量为1、0.1 pg/μL 时，PCR 扩增未能得到目标条带。因此，本研究建立的PCR 检测体系在粒黑穗病菌基因组DNA 质量浓度为10 pg/μL 时能够检出。

2.3 PCR 检测大田谷子植株中的病原菌结果

以谷子穗梗和旗叶顶端组织基因组DNA 作模板，用自行设计的谷子粒黑穗病菌引物进行PCR检测。结果发现，以未拌菌对照组谷子穗梗和旗叶基因组DNA 为模板进行PCR 扩增时，琼脂糖凝胶电泳未检出扩增产物；以拌菌发病植株穗梗和旗叶的基因组DNA 为模板，PCR 扩增检出了谷子粒黑穗病菌的特异性序列（图4）。

以拌菌未发病植株穗梗和旗叶基因组DNA 为模板，用特异性引物进行PCR 扩增，扩增产物电泳结果表明（图5），晋谷21 的5 株植株中有1 株的穗梗及旗叶中扩增出特异性条带，有1 株旗叶中扩增出条带、穗梗中未扩增出条带，其余3 株的穗梗和旗叶中均没有扩增产物；长农35 有4 株的穗梗和旗叶中检测出特异性条带，1 株穗梗和旗叶中均没有检出扩增产物。结果表明，长农35 拌菌组植株中黑穗病菌检出率高于晋谷21，该结果与2 个品种的黑穗病发病率[6]相一致。

3 结论与讨论

谷子粒黑穗病是一种真菌性病害，黑穗病发生的严重程度取决于谷子品种的抗病性和环境条件。本研究根据谷子粒黑穗病菌ITS 序列，设计了1 对引物F1/R1，应用该引物对谷子粒黑穗病菌、白发病菌、谷瘟病菌和玉米黑粉菌基因组DNA 进行PCR扩增，结果表明，只有谷子粒黑穗病菌扩增出1 条特异性条带，说明这对引物对谷子粒黑穗病菌是特异的，且检测到的黑穗病菌基因组DNA 的最低质量浓度为10 pg/μL。对谷种拌菌组植株的检测结果表明，所设计的特异性引物在鉴定植株抗病性方面具有较高的特异性。

朱桂清等[11]用真菌rDNA 非编码区ITS1 的通用引物设计了特异性引物，对小麦散黑穗病菌进行了PCR 检测；程颖慧等[17]根据ITS 片段设计引物检测小麦腥黑穗病菌，并用于与黑麦腥黑粉菌的区分。商蓓等[18]应用真菌rDNA 的ITS 序列设计了对苹果黑星病菌有高度特异性的引物，可检测到苹果黑星病菌基因组DNA 浓度是100 fg/μL；王楠等[19]研究设计的谷子锈病菌IGS 序列特异性引物，利用巢式PCR 建立了对谷子锈病的检测体系，检测到病原菌基因组DNA 最低质量浓度为100 pg/μL。本研究建立的PCR 技术体系能够检测到的谷子粒黑穗病菌基因组DNA 最低质量浓度为10 pg/μL，具有较高的检测灵敏度。

用设计的特异引物对谷种拌菌组发病植株进行病原菌检测，在穗梗和旗叶中都检出特异性条带，表明病原菌随植株的生长发育，对植株顶端的旗叶及穗梗都进行了侵染，病菌对植株的侵染是全身性的。用此引物对拌菌组中未发病植株进行检测，长农35 穗梗与旗叶中检出粒黑穗病菌的植株数多于晋谷21，这与田间植株发病率数据[5]基本一致。本研究建立的PCR 体系可对谷子粒黑穗病菌进行定性检测，对定量检测还需进一步研究。

综上所述，本研究初步建立了谷子粒黑穗病菌的PCR 检测鉴定方法，这种快速、高效的检测手段为今后谷子粒黑穗病菌的检测鉴定提供了基础，并且可以用于检疫研究、流行病害调查、谷子粒黑穗病过程控制和不同谷子品种抗病性鉴定。