薄芝糖肽对胃癌模型大鼠的干预效果及对免疫功能的影响

陈宓 苏州

(1绵阳市第三人民医院(四川省精神卫生中心)肿瘤科，四川 绵阳 621000；2四O四医院肿瘤科)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤〔1，2〕。主要由于生活质量提高，饮食种类过于丰富导致〔3〕。胃癌早期确诊率极低，一旦确诊为胃癌，可能已经到了晚期，因此提高胃癌的确诊率和治疗效果是现代医学最主要的研究课题。胃癌患者免疫力低于正常人〔4，5〕。薄芝糖肽是由灵芝多糖提炼出来的糖肽类药品，可增强抗肿瘤作用，增强免疫力〔6〕。本研究探讨薄芝糖肽对胃癌大鼠的干预效果及对免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物：选择30只BALB/c健康大鼠，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，年龄5～8〔平均(7.5±0.5)〕个月，体重210～230〔平均(225.5±1.5)〕g。所有大鼠饲养在干净笼子里，室温(22.1±1.8)℃，相对湿度38%～42%，每天光照10个小时，喂饮纯净水，清洁级饲养1 w。本研究获得医院伦理委员会批准。主要药物及试剂：薄芝糖肽(北京赛升药业股份有限公司)；白细胞介素(IL)-6、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α(武汉博士德生物工程有限公司)；IL-2抗体(中山康方生物医药有限公司)；重组人细胞信号转导与转录激活因子(STAT)3抗体、血管内皮生长因子(VEGF)多克隆抗体、p53抗体(Santa Cruz公司)；生物显微镜(Olympus公司)；苏木素-伊红(HE)染色剂(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2分组、建模及给药 随机选取10只大鼠作为对照组，另外20只大鼠参照张丹等〔7〕研究实验，于大鼠腹部皮下注射200 mg/kg阿糖胞苷，2 d后行60CO全身照射，剂量为10 Gy，次日在活性良好的胃癌细胞株中加入Ⅰ型胰蛋白酶，进行重悬之后将细胞浓度调整为1×1010/L，在大鼠右腋皮下注射0.8 ml细胞悬液。7 d后大鼠腋下出现直径为1 cm左右的肿块视为胃癌模型建立成功，20只大鼠中有4只建模过程中死亡，2只建模失败，建模成功有14只，将这14只胃癌模型大鼠随机分为胃癌组和薄芝糖肽组各7只。薄芝糖肽组于大鼠腹腔注射2 ml：5 mg(多糖)1 mg(多肽)的薄芝糖肽4 ml，1次/d，连续注射7 d，对照组和胃癌组注射同等剂量的生理盐水。

1.33组细胞CD4+T、CD4+CD25+T、CTL杀伤功能检测 抽取大鼠抗凝外周血，分别加入不同荧光标记的单克隆抗体10 μl，加入100 μl EDTA抗凝的全血中孵育15 min，加入红细胞裂解液，缓冲液(PBS)洗涤3次，使用流式细胞仪检测CD4+T、CD4+CD25+T、CTL细胞分别占淋巴细胞的百分比。

1.4切片及染色 对3组进行全麻处理，采用断头法处死，取其胃黏膜组织，距贲门和幽门1.5 cm离断出全胃，在胃大弯侧部开全胃，取0.2 cm×2.0 cm长条形胃组织，迅速置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，石蜡包埋，HE染色检查。

1.53组IL-6、IL-10、IL-2、TNF-α检测 抽取大鼠尾部静脉血,使用酶联免疫吸附试验检测3组胃癌模型因子IL-6、IL-10、IL-2、TNF-α表达水平。

1.63组STAT3、p53、VEGF检测 Western印迹检测3组胃癌STAT3、p53、VEGF蛋白表达量，取每组4份心肌组织样本，研磨后加入蛋白缓冲液，进行常规蛋白提取，采取二喹啉甲酸(BCA)进行定量分析。50 μg的蛋白样品上样后行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，通过蛋白电转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，使用5%的脱脂奶粉TBST中进行避光封闭1 h，洗涤之后加入一抗稀释溶液(STAT3、p53、VEGF按照1∶1 000比例进行稀释)，在4℃的环境中过夜保存，洗涤后加入二抗稀释溶液(STAT3、p53、VEGF按照1∶5 000比例进行稀释)，在温床中孵育1 h后再次洗涤，加入发光液ECL，曝光2～3次，取重叠值。使用软件分析蛋白条带灰度值。内参蛋白是GAPDH。

1.7统计学方法 采用SPSS19.0软件进行方差分析、独立样本t检验。

2 结 果

2.13组CD4+T细胞、CD4+CD25+T、CTL比较 胃癌组、薄芝糖肽组CD4+T细胞及CTL杀伤功能均显著低于对照组,CD4+CD25+T细胞显著高于对照组(均P<0.05)；薄芝糖肽组CD4+T细胞及CTL杀伤功能均显著高于胃癌组，CD4+CD25+T细胞显著低于胃癌组(均P<0.05)。见表1。

表1 3组CD4+T细胞、CD4+CD25+T细胞及CTL比较

2.23组病理组织观察 对照组胃黏膜组织无任何变化，处于正常水平；胃癌组胃黏膜出现了排列紊乱，黏膜增厚，可见异性增生；薄芝糖肽组胃黏膜腺体排列比较规则，未见明显的异型增生或肠上皮化生。见图1。

图1 3组胃黏膜病理组织观察(HE，×200)

2.33组IL-6、IL-10水平比较 胃癌组、薄芝糖肽组IL-6及IL-10水平均显著高于对照组(均P<0.05)；薄芝糖肽组IL-6、IL-10水平均显著低于胃癌组(均P<0.05)，见表2。

表2 3组IL-6、IL-10、IL-2、TNF-α、STAT3、p53、VEGF水平比较

2.43组IL-2、TNF-α水平比较 胃癌组、薄芝糖肽组IL-2水平均显著低于对照组，TNF-α水平均显著高于对照组(均P<0.05)；薄芝糖肽组IL-2水平显著高于胃癌组，TNF-α水平显著低于胃癌组(均P<0.05)。见表2。

2.53组STAT3、p53、VEGF水平比较 胃癌组、薄芝糖肽组STAT3、p53、VEGF水平均显著高于对照组(均P<0.05)；薄芝糖肽组STAT3、p53、VEGF水平均显著低于对照组(均P<0.05)。见表2、图2。

图2 3组STAT3、p53、VEGF蛋白表达

3 讨 论

胃癌主要是由气血弱易发生的气滞、血瘀、痰凝、耗气伤阴、损伤脾肾导致〔8〕。有研究表明当胃癌发生时，机体免疫功能发生变化导致免疫力下降〔9〕。CD4+T属人体免疫系统中比较重要的一种免疫细胞，简称为CD4细胞，主要是CD4，辅助T细胞表达〔10〕。T淋巴细胞在免疫功能中扮演着重要角色，能指挥身体对抗微生物，比如肿瘤病毒。CD4+T细胞中表面分子CD25表达的不同，可将其分为CD4+CD25低表达的效应性T细胞和CD4+CD25高表达的调节性T细胞〔11〕。CTL是白细胞的亚部，为一种特异T细胞专门分泌各种细胞因子参与免疫功能，对肿瘤及病毒等有杀伤作用，是肿瘤免疫的重要防线〔12〕。IL-6属于细胞因子，能刺激免疫反应的细胞增殖、分化且提高其功能〔13〕。IL-10可调节细胞的生长与分化，参与免疫反应和炎性反应，是现在医学研究中公认的炎症和免疫抑制因子〔14，15〕。IL-2可有效调节免疫系统中白细胞活性，能促进因子繁殖，同样参与抗体反应，造血和肿瘤监视〔16〕。TNF-α可直接杀伤脑肿瘤细胞核，但对正常的细胞无明显毒性〔17〕。STAT可和特定的含磷酸化酪氨酸的肽段结合。STAT被磷酸化后，发生聚合称为同源或聚体形式的活化转录激活因子，进入胞核内与靶基因启动子序列的特定位点结合，促进其转录〔18，19〕。p53基因含有大量的脯氨酸，电泳速度被拖慢。p53基因的失活对肿瘤形成起重要作用。p53基因突变会导致正常生物功能的丧失〔20〕。VEGF在胃癌中有极高的表达，对胃癌新生的血管形成及肿瘤转移和生长起很大的作用。