舒芬太尼通过miR-365-3p/AKT1抑制胃癌细胞迁移及侵袭

黄发斌 陈江兴 吴颜丹 孙成成

(义乌市中心医院麻醉科，浙江 义乌 322000)

胃癌是临床常见恶性肿瘤，具有发病率高等特点，由于胃癌发病机制较为复杂导致胃癌早期诊断及治疗效果不佳〔1〕。因此寻找可靠的诊断标志物对提高胃癌早期诊断及治疗均有重要意义。微小RNA(miRNA)是一类长链非编码单链RNA分子，可通过抑制mRNA或抑制其翻译进而调控蛋白编码基因表达从而参与胃癌等恶性肿瘤细胞迁移及侵袭过程，细胞迁移及侵袭是导致胃癌患者复发及死亡的重要原因〔2,3〕。因而积极探寻以miRNA为治疗靶点的药物对抑制胃癌细胞迁移及侵袭具有重要应用价值。舒芬太尼是一种有效的中枢镇痛药，用于胃癌术后镇痛〔4〕。研究发现一定剂量的舒芬太尼处理食管癌细胞可抑制细胞增殖诱导细胞凋亡〔5〕。但其对胃癌细胞迁移侵袭行为的影响还不清楚。有研究应用miRNA芯片对胃癌细胞株进行miRNA差异表达谱分析发现，miR-365在高转移胃癌细胞中下调表达，但关于其在胃癌发生及发展过程中的研究机制尚未完全阐明〔6〕。蛋白激酶B(AKT1)信号通路参与胃癌的发生、发展、浸润转移，在胃癌的癌变过程中起着重要作用，并有研究证明干扰AKT1表达能抑制胃腺癌细胞增殖、迁移等行为〔7,8〕。通过靶基因预测软件发现AKT1可能是miR-365-3p的靶基因，但舒芬太尼是否可通过调控miR-365-3p/AKT1表达而参与胃癌发生及发展过程尚未可知，因此本研究用舒芬太尼作用于体外培养的胃癌BGC-823细胞，观察药物对胃癌细胞迁移及侵袭的影响，并初步探讨其是否通过调控miR-365-3p/AKT1表达进而发挥作用，进一步探究其可能作用机制，为临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 胃癌BGC-823细胞购自上海生命科学院细胞库。DMEM培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清与胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Lipofectamine2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；细胞裂解液购自北京博蕾德科技发展有限公司；基质胶购自上海伟进生物科技有限公司；磷酸化蛋白激酶B(p-AKT1)抗体购自美国Proteintech公司；miR-365-3p mimics、anti-miR-365-3p及其各自阴性对照均购自上海吉码生物科技有限公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)混合液、结晶紫染液、DEPC水、增强型电化学发光(ECL)试剂均购自江苏碧云天生物科技公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗购自美国Abcam公司；Trizol试剂、PrimeScriptTMRT试剂盒、SYBR Green assay均购自大连宝生物科技有限公司；兔抗人E-钙黏着蛋白(E-cadherin)与基质金属蛋白酶(MMP)-2一抗均购自美国Santa Cruz公司；双荧光素酶报告基因检测试剂与荧光素酶载体均购自北京普洛麦格生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞转染、舒芬太尼处理及分组 胃癌BGC-823细胞培养于DMEM培养基，培养基包含10%胎牛血清与青霉素-链霉素混合溶液，放入37℃、5%CO2培养箱内培养，每隔2 d更换1次培养液，待细胞密度生长至80%左右进行传代培养，弃培养基，用胰蛋白酶消化细胞，加入包含10%胎牛血清与青霉素-链霉素混合溶液的DMEM培养基重悬细胞，培养液与细胞按照1∶3比例进行培养。待细胞生长融合至50%时采用Lipofectamine2000转染试剂进行转染，转染前更换为Opti-MEM减血清培养基，分别用miR-NC、miR-365-3p、anti-miR-NC、anti-miR-365-3p转染入胃癌细胞，分别命名为miR-NC组、miR-365-3p组、anti-miR-NC组、anti-miR-365-3p。

舒芬太尼终浓度0.5 nmol/L、5.0 nmol/L、50.0 nmol/L、500.0 nmol/L分别处理胃癌细胞48 h〔9〕，分别为舒芬太尼0.5 nmol/L组、舒芬太尼5.0 nmol/L组、舒芬太尼50.0 nmol/L组、舒芬太尼500.0 nmol/L组，未经任何处理的胃癌细胞为Con组。筛选出适宜舒芬太尼浓度进行后续研究，为探究舒芬太尼是否通过调控miR-365-3p/AKT1而发挥作用，将anti-miR-365-3p、pcDNA-AKT1及其阴性对照分别转染至胃癌细胞12 h后用舒芬太尼处理48 h，分别为舒芬太尼+anti-miR-NC组、舒芬太尼+anti-miR-365-3p组、舒芬太尼+pcDNA3.1组、舒芬太尼+pcDNA-AKT1组，转染6 h后将细胞培养基更换为含有10%胎牛血清与青霉素-链霉素混合溶液的DMEM培养基，继续培养24 h或48 h后进行后续研究。

1.2.2Transwell小室检测细胞迁移 转染24 h后，胰蛋白酶消化各组胃癌细胞，不含血清的DMEM培养基重悬细胞，调整细胞密度(2×108/L)，吸取100 μl细胞悬液加入Transwell小室的上室，取500 μl含有10%血清的培养基加入Transwell小室的下室，放入37℃、5%CO2培养箱内培养，24 h后取出Transwell小室，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤小室，用棉签擦去Transwell小室的上室中未发生迁移的细胞，用4%多聚甲醛固定20 min，预冷PBS洗涤3次×5 min，用0.1%结晶紫染液染色10 min，PBS洗涤3次×5 min，置于显微镜下随机选取5个视野观察染色细胞。

1.2.3Transwell小室检测细胞侵袭 接种细胞前1 d将Transwell小室放入24孔板中，基质胶稀释后以每孔50 μl的密度平铺于Transwell小室的上室面的底部，细胞悬液以每孔1×105个细胞的密度接种于Transwell小室的上室，取500 μl含有10%胎牛血清与青霉素-链霉素混合溶液的DMEM培养基加入Transwell小室的下室，24孔板置于37℃、5%CO2培养箱内培养48 h，取出小室后弃培养液，使用棉签擦去基质胶及微孔膜上的细胞，4%多聚甲醛固定后，用0.1%结晶紫染液染色10 min，显微镜下随机选取5个视野计算穿过小室的细胞数，实验均设置3次重复。

1.2.4qRT-PCR检测细胞中miR-365-3p的表达水平 收集各组对数生长期胃癌细胞，加入1 ml Trizol试剂及0.2 ml的氯仿，置于涡旋振荡器振荡1 min，室温静置3 min，低温条件下，12 000 r/min转速离心15 min，吸取上层水相置于无菌无酶的1.5 ml离心管内，加入0.5 ml异丙醇后室温静置20 min，低温条件下，12 000 r/min转速离心15 min，弃上清后得到RNA白色沉淀，用75%乙醇洗涤2次，置于超净工作台晾干，加入适量DEPC水溶解RNA，测定RNA浓度。参照反转录试剂盒说明书进行操作，反应体系共10 μl：5×PrimeScript缓冲液2 μl，Prime Script RT Enzyme 0.5 μl，Oligo dT引物0.5 μl,随机6引物0.5 μl，RNA 500 ng(根据RNA浓度计算加入RNA体积)，经反转录得到cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR反应，反应体系为SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各0.8 μl，ddH2O补足至20 μl。反应条件为95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 15 s，循环40次，miR-365-3p以U6为内参基因，2-ΔΔCt法计算miR-365-3p的相对表达量。

1.2.5Western印迹检测细胞中E-cadherin、MMP-2、p-AKT1的蛋白表达 收集各组胃癌细胞，加入预冷的蛋白裂解液，冰上放置30 min，低温离心15 min，提取细胞蛋白，利用二喹啉甲醛(BCA)试剂盒测定蛋白浓度，加入SDS上样缓冲液高温下放置促使蛋白变性，经SDS-PAGE分离蛋白，用湿法将分离的蛋白凝胶转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，分别加入E-cadherin、MMP-2、p-AKT1一抗(稀释比1∶100)，4℃条件下孵育24 h，TBST洗涤3次×5 min，加入二抗(稀释比1∶500)，室温封闭90 min后滴加ECL液，置于凝胶成像系统曝光，应用Quantity One软件分析蛋白灰度值。

1.2.6双荧光素酶报告基因检测 将含有miR-365-3p与AKT1的3′UTR结合位点及突变位点的序列分别插入荧光素酶报告基因质粒中，构建野生型荧光素酶报告载体WT-AKT1及突变型荧光素酶报告载体MUT-AKT1，同时将胃癌细胞接种于24孔板，继续培养24 h后将100 ng的WT-AKT1、MUT-AKT1分别与20 ng的miR-365-3p mimcs及其阴性对照进行共转染，参照Lipofectamine2000转染试剂对胃癌细胞进行转染，转染48 h后应用双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。

1.3统计学方法 应用SPSS19.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1舒芬太尼对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭的影响 用不同浓度的舒芬太尼处理胃癌细胞，Transwell迁移及侵袭实验结果显示，与Con组比较，舒芬太尼0.5 nmol/L组、舒芬太尼5.0 nmol/L组、舒芬太尼50.0 nmol/L组、舒芬太尼500.0 nmol/L组胃癌BGC-823细胞迁移及侵袭细胞数均显著减少(P<0.05)，随着舒芬太尼使用剂量的增加胃癌BGC-823细胞迁移及侵袭细胞数均显著减少(P<0.05)，呈一定量效关系，见图1、表1，表明舒芬太尼可有效抑制胃癌细胞迁移及侵袭。Western印迹检测细胞增殖及侵袭相关蛋白表达，与Con组比较，舒芬太尼0.5 nmol/L组、舒芬太尼5.0 nmol/L组、舒芬太尼50.0 nmol/L组、舒芬太尼500.0 nmol/L组胃癌BGC-823细胞中E-cadherin的表达水平显著升高(P<0.05)，且随着剂量的增加而显著升高(P<0.05)，而MMP-2的表达水平显著降低(P<0.05)，且随着剂量的增加而显著降低(P<0.05)，见图2、表2，表明舒芬太尼可通过促进E-cadherin表达及下调MMP-2表达而抑制胃癌细胞迁移及侵袭。

图1 舒芬太尼对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭细胞数目的影响(结晶紫染色，×200)

表1 舒芬太尼对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭及miR-365-3p表达、迁移、侵袭蛋白表达的影响

1～5：Con组,舒芬太尼0.5 nmol/L组,舒芬太尼5.0 nmol/L组,舒芬太尼50.0 nmol/L组,舒芬太尼500.0 nmol/L组图2 舒芬太尼对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭蛋白表达的影响

2.2舒芬太尼对胃癌细胞BGC-823中miR-365-3p表达的影响 不同浓度的舒芬太尼处理胃癌细胞后细胞中miR-365-3p的表达水平较Con组显著升高(P<0.05)，随着不同剂量的增加miR-365-3p的表达水平显著升高(P<0.05)，且呈剂量依赖效应。表明舒芬太尼可促进miR-365-3p的表达。其中舒芬太尼使用剂量为50.0 nmol/L时miR-365-3p表达水平显著升高，因此以此浓度处理细胞进行后续实验。见表1。

2.3过表达miR-365-3p对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭的影响 将miR-365-3p mimics转染至胃癌细胞，qRT-PCR验证转染效率，miR-365-3p组胃癌细胞中miR-365-3p的表达水平与miR-NC组相比显著升高(P<0.05)，表明成功上调胃癌细胞中miR-365-3p的表达水平。与miR-NC组比较，miR-365-3p组胃癌细胞迁移及侵袭数均显著减少(P<0.05)，能够明显促进E-cadherin的表达(P<0.05)，显著抑制MMP-2的表达(P<0.05)，见表2、图3，表明miR-365-3p过表达后可通过上调E-cadherin表达及下调MMP-2的表达进而抑制胃癌细胞迁移及侵袭能力。

表2 过表达miR-365-3p对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭的影响

图3 过表达miR-365-3p对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭的影响

2.4抑制miR-365-3p表达能逆转舒芬太尼(50.0 nmol/L)对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭的作用 将anti-miR-365-3p转染至胃癌细胞后用浓度为50.0 nmol/L的舒芬太尼处理48 h，观察胃癌细胞迁移及侵袭能力变化，如表3、图4所示，与舒芬太尼+anti-miR-NC组相比，舒芬太尼+anti-miR-365-3p组胃癌细胞中miR-365-3p的表达水平显著降低(P<0.05)，迁移及侵袭数均显著增多(P<0.05)，E-cadherin表达明显下调(P<0.05)，而MMP-2表达明显下调(P<0.05)，表明舒芬太尼可通过上调miR-365-3p的表达进而抑制胃癌细胞迁移及侵袭能力。

表3 抑制miR-365-3p能逆转舒芬太尼对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭的作用

2.5miR-365-3p靶向调控AKT1 为明确miR-365-3p的结合位点，应用靶基因预测软件，结果显示miR-365-3p与AKT1的3′UTR区域互补，见图5。胃癌细胞转染miR-365-3p mimics后，采用双荧光素酶报告实验检测荧光素酶活性，结果显示，miR-365-3p可显著抑制野生型WT-AKT1的荧光素酶活性(P<0.05)，但对突变型MUT-AKT1的荧光素酶活性无明显抑制作用(P>0.05)，见表4。表明miR-365-3p可结合AKT1的3′UTR序列位点。为明确胃癌细胞转染miR-365-3p mimics后AKT1磷酸化(p-AKT1) mRNA表达水平的变化，应用qRT-PCR技术对胃癌细胞p-AKT1 mRNA表达水平进行检测，结果显示，转染miR-365-3p mimics可显著减少p-AKT1 mRNA表达(P<0.05)，转染anti-miR-365-3p可显著增加p-AKT1 mRNA表达(P<0.05)。Western印迹显示，转染miR-365-3p mimics可显著减少p-AKT1的蛋白表达(P<0.05)，转染anti-miR-365-3p可显著增加p-AKT1的蛋白表达(P<0.05)。见表5、图6。表明miR-365-3p可负性调控靶基因AKT1的表达。

1～4：Con组,舒芬太尼组，舒芬太尼+anti-miR-NC组,舒芬太尼+anti-miR-365-3p组图4 抑制miR-365-3p表达能逆转舒芬太尼对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭的抑制作用

图5 miR-365-3p与AKT1的3′UTR区域互补

表4 双荧光素酶报告实验

表5 miR-365-3p调控p-AKT1的表达

2.6过表达AKT1能逆转舒芬太尼对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭的抑制作用 将pcDNA-AKT1转染至胃癌细胞后用剂量浓度为50.0 nmol/L的舒芬太尼干预48 h，结果显示，与舒芬太尼+pcDNA3.1组相比，舒芬太尼+pcDNA-AKT1组胃癌细胞迁移及侵袭数均显著增加(P<0.05)，p-AKT1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，E-cadherin表达显著降低(P<0.05)，MMP-2表达显著升高，见图7、表6。表明舒芬太尼可通过抑制AKT1表达而抑制胃癌细胞迁移及侵袭能力。

1～4：miR-NC组，miR-365-3p组,anti-miR-NC组，anti-miR-365-3p组图6 p-AKT1蛋白的表达

1～4：Con组，舒芬太尼+pcDNA3.1组，舒芬太尼+pcDNA3.1-AKT1组图7 过表达AKT1能逆转舒芬太尼对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭的抑制作用

表6 过表达AKT1能逆转舒芬太尼对胃癌细胞BGC-823迁移、侵袭的抑制作用

3 讨 论

胃癌细胞细胞增殖活性、迁移及侵袭能力越强其恶性程度越高进而促进肿瘤组织生长，癌基因激活或抑癌基因失活可促进胃癌细胞迁移及侵袭〔10〕。因而抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭可抑制肿瘤组织生长。目前胃癌的治疗水平已有所提高，但患者生存率仍显著降低〔11〕。研究表明miRNA表达水平异常与胃癌细胞增殖、迁移及侵袭过程密切相关〔12〕。

舒芬太尼与地佐辛定共同作用时可减轻胃癌根治术患者术后疼痛感并可减少不良反应的发生〔13〕。舒芬太尼与右美托咪联合作用时可通过降低胃癌患者血清炎性因子进而发挥镇痛作用，同时可恢复患者认知功能〔14,15〕。舒芬太尼作为阿片类镇痛药，其镇痛效果较其他阿片类药物明显增强，而阿片类药物具有抑制肿瘤生长的作用，研究表明舒芬太尼可通过抑制胃癌细胞增殖并诱导细胞凋亡而抑制胃癌发生及发展〔16〕。然而舒芬太尼在胃癌发生及发展过程中的可能作用机研究相对较少，因此本研究用不同浓度舒芬太尼处理胃癌细胞，结果发现胃癌细胞迁移及侵袭能力明显受到抑制，并可促进E-cadherin表达，而抑制MMP-2表达，同时已有研究表明E-cadherin是一种跨膜蛋白且广泛分布于多种上皮细胞中，并可通过与β-连环蛋白(β-catenin)形成复合物进而增强细胞间的黏附力从而抑制肿瘤细胞转移，若E-cadherin表达降低或不表达则可导致肿瘤细胞迁移及侵袭，MMP-2可通过降解细胞外基质及基底膜成分进而促进肿瘤细胞迁移及侵袭〔17〕。提示舒芬太尼可通过上调E-cadherin表达及下调MMP-2表达进而抑制胃癌细胞迁移及侵袭。

miR-365可通过下调Wnt5a表达进而抑制卵巢癌进发生及发展〔18〕。miR-365-3p在口腔鳞状细胞癌及肝细胞癌中呈低表达，上调miR-365-3p表达可抑制肿瘤细胞增殖活性〔19,20〕。本研究结果提示舒芬太尼可能通过上调miR-365-3p的表达进而参与胃癌细胞迁移及侵袭过程；miR-365-3p过表达可通过上调E-cadherin表达及下调MMP-2表达进而抑制胃癌细胞迁移及侵袭；舒芬太尼可通过上调miR-365-3p表达进而抑制胃癌细胞迁移及侵袭。

研究表明长非编码RNA STXBP5-AS1通过抑制胃癌细胞中的PI3K/AKT信号通路抑制细胞增殖、迁移及侵袭〔21〕。相关报道指出PI3K/Akt1通路激活可促进胃癌细胞增殖及迁移〔22〕。本研究结果说明AKT1过表达可增强胃癌细胞迁移及侵袭能力，提示舒芬太尼可通过上调miR-365-3p表达而抑制靶基因AKT1表达进而抑制胃癌细胞迁移及侵袭。