基于小RNA深度测序和RT-PCR检测侵染大豆的病毒种类

王秋实，闫哲，李玮瑜，杨爱珍，任俊达，尚巧霞*

（1.北京农学院，生物与资源环境学院/农业农村部华北都市农业重点实验室，北京102206；2.北京农学院，植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室/植物生产国家级实验教学示范中心，北京102206）

大豆作为山西省主要栽培作物之一，年播种面积400余万亩。大豆病毒病是大豆（Glycine max（Linn.））生产中的主要病害，严重影响大豆产量和品质［1，2］，通常年份减产5%～7%，发病严重年份减产达到10%～25%，个别严重发病地块会出现绝收的情况［2～4］。

侵染大豆的病毒种类众多，我国已经报道的有50多种，常见的病毒包括大豆花叶病毒（soybean mosaic virus，SMV）［4］、蚕豆萎蔫病毒2号（broad bean wilt virus 2，BBWV-2）［5］、菜豆荚斑驳病毒（bean pod mottle virus，BPMV）［6］、南方菜豆花叶病毒（southern bean mosaic virus，SBMV）［7］、烟草环斑病毒（tobacco ringspot virus，TRSV）［8］、番茄环斑病毒（tomato ringspot virus，ToRSV）［9］、花生斑驳病毒（peanut mottle virus，PeMoV）［10］、菜豆黄化花叶病毒（bean yellow mosaic virus，BYMV）［11］、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）［12］、大豆矮化病毒（soybean stunt virus，SSV）［13］、烟草坏死病毒（tobacco necrosis virus，TNV）［14］、苜蓿花叶病毒（alfalfa mosaic virus，AMV）、南芥菜花叶病毒（arabis mosaic virus，Ar-MV）、烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）［15］、花生矮化病毒（peanut stunt virus，PSV）［16］、花生条纹病毒（peanut stripe virus，PStV）等［17］。其中SMV在我国大豆产区普遍发生，严重影响大豆生产［3］。目前报道的检测大豆病毒的方法较多，如袁俊杰等［7］利用添加扩增内标的逆转录重组酶聚合酶扩增技术（IAC-RT-RPA）检测大豆中的SMV、BPMV、SBMV；李小宇等［18］利用间接ELISA检测方法检测SMV；袁俊杰等［19］利用一步法逆转录重组酶聚合酶常温扩增（RT-RPA）技术检测SBMV、SMV、ArMV、TRSV、BPMV；张雯娜［20］等利用逆转录环介导等温扩增技术检测（RT-LAMP）SMV、TMV、CMV；张明哲等［21］利用纳米上转换荧光技术检测SMV；易汪雪等［22］利用多重RT-PCR方法同时检测BPMV、TRSV、ToRSV；廖芳等［23］利用RT-PCR和实时荧光RTPCR一步法检测BPMV。由于侵染大豆的病毒种类较多，前人研究多以血清学和核酸扩增技术进行已知特定病毒的特异性检测，不能测定未知病毒的种类，检测结果不完整［24］。HU Qian-qian等［25］利用深度测序技术首次检测到中国天然侵染大豆的黄斑病病毒。深度测序技术可以不依赖于已知病毒信息，一次性全面的对样品进行检测提高了检测效率；因其适合于发现新病毒的优点，近年来逐渐成为植物RNA病毒检测常规方法［24～27］。

山西省太谷县大豆种植历史悠久，大豆病毒病发生普遍，但有关病毒种类的检测少见相关报道。本研究首次应用小RNA深度测序技术同时结合田间调查和RT-PCR方法，可以快速、准确的检测出侵染大豆的病毒种类，能够为不同品种大豆的种质资源筛选和病毒病抗性研究提供依据，并为大豆病毒病的防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2019年8月于山西省晋中市太谷县大豆种植基地进行不同品种病毒病症状观察和样品采集。共采集36个大豆品种的叶片（表1），样品采集后尽早置于-80℃保存。

表1 用于测定病毒种类的36个大豆品种名称Table 1 Name of 36 soybean varieties for determining virus species

1.2 主要试剂和仪器

EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）；2×Taq PCR Mix（北京艾德莱生物科技有公司）、Random 9 Primer（50 μmol·L-1，Takara公 司）、Oligo（dT）18 Primer（50 μmol·L-1，Takara公司）、d NTPs（10 mmol·L-1，Takara公司）、DEPC水（上海生工生物有限公司）、5×M-MLV Buffer（Takara公司）、M-MLV（100 U·μL-1，Takara公司）、Recombinant RNase Inhibitor（40 U·μL-1，Takara公司）、无水乙醇分析纯、琼脂糖、核酸染料Gelview、DL 2000 DNA Marker（Takara公司）。

Retsch MM 400型研磨仪；eppendorf Centrifuge 5417 R型离心机（大）；eppendorf minispin plus型离心机（小）；恒温水浴锅；德国Biometra TGradient梯度PCR仪；MUTAD-EXU型电泳仪；GALANZWP800TL 23-K3型微波炉；BIO-RAD GelDosTM EZ IMAGER凝胶成像仪；SANYO AOTOCLAVE MLS-3750型高压蒸汽灭菌锅。

1.3 小RNA深度测序

将采集的具有典型症状的大豆叶片样品36份送至北京优吉科技有限公司测序。

1.4 RT-PCR检测

1.4.1 引物设计

参照王佳、崔丽艳、王宝霞等设计的CMV、SMV和BBWV特异性引物，目的片段大小为430～971 bp（表2）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表2 用于RT-PCR检测CMV、SMV、BBWV-2的引物Table 2 Primers for CMV，SMV and BBWV-2 detection by RT-PCR

1.4.2 大豆叶片总RNA提取

分别取36份大豆病样叶片组织各100 mg，用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒分别提取其总RNA，-80°C保存备用。

1.4.3 反转录

取5μL病样RNA，用TaKaRa公司制备的随机引物反转录合成cDNA。反转录反应体系为RT 1体系：Random 9 Primer（50μmol·L-1）0.5μL，Oligo（dT）18 Primer（50μmol·L-1）0.5μL，dNTPs（10 mmol·L-1）2μL，DEPC水11μL，提 取 的 总RNA 1.5μL。RT 2体系：5×M-MLV Buffer 4 μL，M-MLV（100 U·μL-1）0.5μL，Recombinant RNase Inhibitor（40 U·μL-1）0.5μL。具体方法：将RT 1离心混匀后于65°C水浴5 min，冰浴5 min；上述反应结束后将RT 2加入其中，42°C反应1 h，70°C反应15 min，获得的cDNA产物于-20°C保存备用。

1.4.4 PCR检测

PCR反应体系：上述反转录产物2μL，2×Taq PCR MIXER 12.5μL，10μmol·L-1的上、下游引物各0.5μL，加dd H2O至终体积25μL。反应程序：94°C预变性2 min，94°C变性30 s，X°C退火45 s，72°C延伸1 min，变性、退火、延伸35个循环；72°C再延伸反应5 min；退火温度根据引物各自的熔解温度确定。反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检验RT-PCR扩增产物。

1.5 序列测定和分析

选取清晰、具有单一条带的PCR产物，送交生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。将测序结果在NCBI上与国内外已报道的相关序列进行同源性分析。

2 结果与分析

2.1 典型病害症状

大豆病毒病在田间发生普遍，病株叶片上产生斑驳症状、叶面凹凸不平，发病严重时叶片出现部分坏死、严重皱缩，植株矮化。采集的36个不同品种样品均为具有叶片斑驳、坏死或植株矮化等明显症状的大豆叶片，样品症状不一，多为两种或以上症状同时出现（图1）。

图1 大豆病毒病田间症状Fig.1 Field symptoms of soybean virus disease

2.2 小RNA深度测序分析

样品经测序共获得32716152条小RNA序列，占总小RNA序列数的15.25%，其长度分布如图2所示。其中，21 nt长度的小RNA序列所占比例最多，为82.30%。选取18～26 nt的序列拼接组装，获得6090个contigs，将获得的contigs与NCBI数据库进行比对，最终获得377个被注释的contigs。通过小RNA深度测序从大豆样品中检测出3种病毒，分别为CMV、SMV和BBWV-2，与以上病毒比对上的contigs分别为105、267、5（表3）。

图2 小RNA长度分布Fig.2 Small RNA length distribution

表3 小RNA深度测序分析出的病毒种类及科属情况Table 3 The virus species and the family and genus were analyzed by deep sequencing of small RNA

2.3 RT-PCR检测结果与病毒侵染情况

2.3.1 大豆样品RT-PCR检测

提取大豆样品的RNA，并利用特异性引物进行RT-PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。含有CMV、SMV和BBWV-2的样品可以分别扩增出430 nt、820 nt和971 nt的目的片段（图3）。

图3 琼脂糖凝胶电泳检测大豆样品中不同病毒的RTPCR扩增产物Fig.3 Agarose gel electrophoresis of different products of viruses infecting soybean amplified by RT-PCR

2.3.2 不同病毒分离物序列分析

含有CMV的阳性样品经RT-PCR扩增出含有部分RNA 33'端非编码区核苷酸序列约430 nt的片段。选取扩增条带明亮的PCR产物测序后获得CMV山西太谷大豆分离物（CMV-STS）序列，GenBank登录号为MW556479。目前GenBank登录的CMV大豆分离物序列除本文测定的CMVSTS序列外，仅有CMV韩国分离物209序列（GenBank登录号：KJ400004.1），与CMV-STS的同源性为94.90%。

利用SMV特异性引物进行RT-PCR检测，阳性样品可以扩增出820 nt的片段，含有部分5'端非编码区核苷酸序列。经序列测定，获得SMV山西太谷大豆分离物序列（SMV-STS），GenBank登录号为MW556478。与国内外已报道的SMV大豆分离物序列进行同源性比对，SMV-STS与山西分离物SX同源性最高为99.59%，与美国、加拿大、韩国和印度分离物的同源一致性为94.77%～96.15%（表4）。

表4 SMV-STS与其他SMV分离物核苷酸同源性分析Table 4 Nucleotide homology analysis between SMV-STS and other SMV isolates

利用BBWV-2特异性引物进行RT-PCR检测，阳性样品可以扩增出971 nt的片段，含有RNA 1部分核苷酸序列。测序后获得BBWV-2山西太谷大豆分离物序列（BBWV-2-STS），Gen-Bank登录号为MW556484，与中国、日本和韩国等不同国家的BBWV-2分离物序列（GenBank登录号 分 别 为 JX575182.1、AB013615.1和KT 246495.1）的同源一致性为90.91%～93.94%（表5）。

表5 BBWV-2-STS与其他BBWV-2分离物核苷酸同源性分析Table 5 Nucleotide homology analysis between bbWV-2-STS and other bbWV-2 isolates

2.3.3 大豆样品中病毒侵染情况

根据RT-PCR检测和序列测定结果明确了侵染大豆的主要病毒种类，在36个品种中仅有1个品种未检测到病毒，本次调查的大豆样品中的病毒检出率为97.2%。已经确定的3种病毒中，CMV的检出率最高，为97.2%。SMV检出率为94.4%，只有2号和13号样品（黄淮WE-1和韩国小黑豆）未检测到SMV；BNV-2检出率为13.9%，仅有26号、31号、34号、35号和36号等5个品种（扁茎1、山农作科-3、祁县豆、复61和广灵大黑豆）中检测到BBNV-2（表6）。

表6 侵染大豆的病毒种类检测结果Table 6 Detection result of viruses infecting soybean in Taigu，Shanxi

所有样品中只有13号样品仅检测到1种病毒，其余34株样品均为2种或是3种病毒的复合侵染，复合侵染率为97.1%（复合侵染株数占病毒检出总植株数的比率）。同时被两种病毒所侵染的样品有29株，占病毒检出总植株数的82.9%，均为CMV和SMV共同侵染；同时被CMV、SMV和BBNV-2侵染的样品有5株，占病毒检出总植株数的14.3%。

3 讨论

自小RNA深度测序技术问世以来被广泛应用于病毒的检测。病毒侵染植物后，可诱导寄主植物产生双链小分子RNA（dsRNA），在寄主体内经过加工生成小干扰RNA（Small interfere RNA，siRNA）［28］。siRNA能够识别病毒并与之结合、切割并将其降解为片段，因此可以在深度测序中检测到与病毒序列高度一致的RNA片段［29］。与宏基 因 组 学（Metagenomic Technology）相 比，小RNA深度测序技术不需要进行病毒的富集，同时具有更高的灵敏度，后期在数据处理上更简便。同传统病毒检测方法相比，小RNA深度测序技术可以在缺少病样中病毒信息的情况下进行病毒检测，全面扫描病样中含有的病毒，同时可以检测到未知病毒［30，31］。

本研究首次应用小RNA深度测序技术同时结合田间调查和RT-PCR技术，对采自山西省晋中市太谷县的大豆叶片进行检测，能够全面、快速、准确的检测出侵染大豆的病毒种类。共检测出3种病毒，分别为CMV、SMV和BBWV-2，其中CMV和SMV为优势病毒，检出率高达97.2%和94.4%，并且复合侵染情况发生普遍，测定的36个品种中34个品种均为2种或是3种病毒的复合侵染，复合侵染率为97.1%，其中多数样品由CMV和SMV共同侵染，占病毒检出总品种数的82.9%。病毒侵染可导致大豆叶片斑驳、畸形、植株矮化等症状［3］。大豆植株受病毒侵染后往往多种症状同时出现，仅凭症状不能判定病毒种类［32］。

2011年发现安徽省侵染大豆的病毒以SMV为主，其次为PSV和SBMV；黑龙江省侵染大豆的病毒同样为SMV，其次为AMV和TNV［33］。同太谷县相比，侵染大豆的病毒种类有所差异，但都存在SMV侵染，并且侵染极为严重。造成这种现象的原因可能与地理位置、天气状况、传播介体或大豆品种有关。

SMV寄主范围较窄，依靠蚜虫以非持久方式传播或机械传播，能侵染少数豆科植物［2］。CMV是目前寄主范围最广的植物病毒之一，可以依靠蚜虫、种子、摩擦等方式进行传播，可侵染千余种植物［34］。太谷县大豆病毒病严重，推测原因可能与蚜虫发生和田间操作有关。目前在大豆生产中主要以清除田间杂草为主，忽视了人为操作造成的病毒传播，没有重视蚜虫的防治并且田间大多为复合侵染，病毒病复合侵染会造成更加严重的经济损失［2～4］。针对以上情况，大豆生长期进行蚜虫防控工作、及时拔出病株、注意防止农事操作过程中病毒的人为传播；结合病毒检测，选育抗病品种；以治理蚜虫防控病情为主，多种防治手段结合应用，可控制大豆病毒病的发生，并降低经济损失。

4 结论

利用小RNA深度测序技术和RT-PCR方法鉴定出危害太谷县大豆的病毒共有3种，分别为CMV、SMV、BBWV-2。其中CMV和SMV病毒检出率超过94%，是危害大豆的优势病毒。此外，太谷县大豆上多种病毒复合侵染现象严重，以CMV和SMV复合侵染为主要的侵染形式。明确侵染太谷县大豆的病毒种类，为大豆病毒病的防控提供了理论依据。