干露时间对凡纳滨对虾抗氧化功能的影响

王茁宇，杨春桥，王秋举，周井祥，梁 杰，张瑞雪，袁海延

( 1.吉林农业大学 动物科学技术学院，吉林 长春 130118； 2.长春市水产品质量安全检测中心，吉林 长春 130033； 3.吉林省水产技术推广总站，吉林 长春 130021 )

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)，又称南美白对虾，属节肢动物门、滨对虾属，是全世界养殖范围最广且产量最高的一种经济对虾。我国凡纳滨对虾养殖产量逐年递增，据2018中国渔业统计年鉴，中国凡纳滨对虾总产量达1.672×106t，因此，凡纳滨对虾养殖是我国水产养殖业的重要组成部分，在我国对虾养殖业中占据着举足轻重的地位[1]。凡纳滨对虾具有抗逆性强、生长速度快、出肉率高和适宜高密度工厂化养殖等优点，它的肉质鲜美，富含蛋白、维生素等营养物质，是最受消费者欢迎的水产品之一[2]。

高密度养殖是目前凡纳滨对虾养殖业的突出特点之一，这种养殖模式虽然能够提高产量和经济效益，但是养殖过程中容易出现缺氧、对虾抗应激能力差和体质差的现象。对于消费者来说，活虾更受消费者喜爱，价格也比死虾高出很多[3]，因此凡纳滨对虾的活体运输尤为重要。目前，凡纳滨对虾的运输还是采用活体带水运输方式，未实现无水运输，这不仅增加了凡纳滨对虾的运输成本，同时也提高了运输时操作的复杂性[4]。因此，干法运输是未来发展的必然趋势。但是对于凡纳滨对虾来说无水环境是一种强烈的缺氧应激，并且打乱了机体的稳态，引发氧化应激反应，从而导致机体损伤，严重时导致对虾死亡[5-6]。氧化应激是水产动物所受应激类型中极为常见的一种类型，任何一种较为强烈的应激均伴随着氧化应激的发生[7-8]，动物机体的抗氧化能力对于抵抗氧化应激具有重要的作用。因此，笔者以空气暴露为刺激因子，在缺氧的条件下，全面检测凡纳滨对虾抗氧化代谢指标，探索缺氧不同时间段凡纳滨对虾抗氧化酶活性的变化规律，总结对虾机体抗氧化剂和抗氧化能力的时空图谱，为养殖过程中缺氧现象提供基础资料，为凡纳滨对虾无水运输技术的开发提供辅助参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料来源与养殖管理

试验所用300尾凡纳滨对虾为采自吉林省一养殖场淡化养殖的成虾。挑选体长(8.32±1.43) cm健康有活力的个体作为研究对象，送至吉林农业大学水产养殖室于100 L经避光处理水族桶中暂养2周以适应环境。暂养期间，水温(25±1) ℃，盐度5，溶解氧水平>5.00 mg/L，氨氮质量浓度<0.20 mg/L，亚硝态氮质量浓度<0.10 mg/L，pH 7.6～8.0，每日7:00和19:00进行饱食投喂，停止摄食后0.5～1.0 h吸取残饵，每2 d换水1/3，不间断充氧，记录投喂量和虾死亡情况。

1.2 试验设计

试验开始前禁食24 h，从每桶中随机选取个体分为4组，进行空气暴露试验，根据预试验，推测出凡纳滨对虾最适暴露时间，分别设置0、5、15、30 min组，每组3个平行，每平行25尾虾，放置封闭空间实验台上，25 ℃室温中进行暴露，暴露过程中保证样品存活，以鳃丝运动，镊子接触头胸部触角有反应视为存活。

1.3 样品收集和粗酶液制备

在空气暴露0、5、15、30 min时间点进行样品收集，每个时间点随机取60尾存活样品，3个平行中每个平行取20尾进行相关抗氧化指标测定，分别采取肌肉、心脏、胃、肠道、肝胰腺、血淋巴6个组织，每个平行制成混合样本。此过程均在冰上操作。血淋巴经4 ℃过夜后，3500 r/min，4 ℃离心10 min后取上清液，血清于-20 ℃保存，其余组织放入无酶管中于-80 ℃保存。将组织解冻剪成小块准确称量质量放入10 mL离心管中，加入9倍体积0.86%生理盐水进行4 ℃组织匀浆，匀浆后4 ℃、3500 r/min离心制成粗酶液，在24 h内测定完毕。

1.4 样品的测定

采用考马斯亮蓝法测蛋白含量(试剂盒型号A045-2)，抽提法测总超氧化物歧化酶活性(总超氧化物歧化酶，试剂盒型号A001-2)，微量定磷法测γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性(γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，试剂盒型号A091-1)，TBA法测丙二醛含量(丙二醛，试剂盒型号A003-1)，FRAP法测总抗氧化能力(总抗氧化能力，试剂盒型号A015-3)，以上测定均采用南京建成生物工程研究所试剂盒，按照说明书进行操作。

1.5 数据分析

试验数据采用SPSS 19.0进行统计分析，数据用平均数±标准误(n=3)，数据统计应用单因素方差分析及Duncan′s多重比较，以P<0.05作为差异显著。

2 结 果

2.1 干露时间对凡纳滨对虾丙二醛含量的影响

不同的暴露时间对凡纳滨对虾各组织丙二醛含量的影响见图1。在整个试验过程中，随着暴露时间的增加，肌肉组织的丙二醛质量摩尔浓度无显著变化；心脏组织的丙二醛质量摩尔浓度呈现先降后升的趋势，在暴露5 min时空气暴露组与其他组相比显著降低(P<0.05)；胃组织的丙二醛质量摩尔浓度呈现先升后降的趋势，与对照组相比均显著>升高(P<0.05)；凡纳滨对虾血清中丙二醛质量摩尔浓度呈现升高的趋势，暴露15 min以后的各空气暴露组与对照组相比显著升高(P<0.05)；肝胰腺组织的丙二醛质量摩尔浓度呈现升高的趋势，暴露5 min后的空气暴露组与对照组相比显著升高(P<0.05)；肠道组织的丙二醛质量摩尔浓度呈现先降后升的趋势，暴露30 min后的空气暴露组与对照组相比显著升高(P<0.05)。

图1 不同的暴露时间对凡纳滨对虾各组织丙二醛质量摩尔浓度的影响Fig.1 Effects of different exposure times on MDA molality in various tissue of Pacific white shrimp L. vannameia.肌肉； b.心脏； c.胃； d.血清； e.肝胰腺； f.肠道；图柱上不同小写字母分别表示不同暴露时间组之间有显著差异(P<0.05)，下同.a.muscle; b.heart; c.stomach; d.serum; e.hepatopancreas; f.intestine; different letters on the bar indicate significant differences between different exposure time groups (P<0.05), et sequentia.

2.2 干露时间对凡纳滨对虾总抗氧化能力的影响

不同的暴露时间对凡纳滨对虾各组织总抗氧化能力的影响见图2。随着暴露时间的增加，凡纳滨对虾肌肉组织总抗氧化能力无显著变化；心脏组织的总抗氧化能力呈先升后降的趋势，暴露5 min组和15 min组与对照组相比显著上升(P<0.05)；胃组织总抗氧化能力呈先升后降的趋势，与对照组相比各组别呈显著性变化(P<0.05)；空气暴露组对虾血清中总抗氧化能力显著高于对照组(P<0.05)；肝胰腺组织总抗氧化能力呈下降的趋势，各空气暴露组与对照组相比显著降低(P<0.05)；肠道组织总抗氧化能力呈先升后降的趋势，与对照组相比各组呈显著性变化(P<0.05)。

图2 不同的暴露时间对凡纳滨对虾各组织总抗氧化能力的影响Fig.2 Effects of different exposure time on T-AOC levels in various tissues of Pacific white shrimp L. vannamei

2.3 干露时间对凡纳滨对虾总超氧化物歧化酶活性的影响

不同暴露时间对凡纳滨对虾各组织总超氧化物歧化酶活性有明显的影响(图3)。随着暴露时间的增加，凡纳滨对虾肌肉组织总超氧化物歧化酶活性呈显著降低(P<0.05)；心脏组织的总超氧化物歧化酶活性在暴露15 min后呈显著升高的趋势(P<0.05)；胃组织的总超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趋势，在暴露5 min时与其他组相比显著升高(P<0.05)；血清的活性呈先升后降的趋势，与对照组相比各组显著升高(P<0.05)；肝胰腺组织的总超氧化物歧化酶活性呈显著下降的趋势(P<0.05)；肠道组织的总超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趋势，在暴露5 min时与其他组相比显著升高(P<0.05)。

图3 不同的暴露时间对凡纳滨对虾各组织总超氧化物歧化酶活性的影响Fig.3 Effects of different exposure time on T-SOD activities in various tissues of Pacific white shrimp L. vannamei

2.4 干露时间对凡纳滨对虾γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的影响

不同的暴露时间对凡纳滨对虾各组织γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的影响见图4。随着暴露时间的延长，凡纳滨对虾肌肉组织γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性无显著变化；心脏组织的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性呈先降后升再降的趋势，暴露5 min组和30 min组与对照组和15 min组相比显著下降(P<0.05)；胃组织的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性呈先升后降的趋势，暴露5 min组与其他组相比显著升高(P<0.05)；血清组织的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性呈先升后降的趋势，暴露15 min组和对照组相比显著升高(P<0.05)；肝胰腺组织的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性呈下降趋势，与对照组相比，各组显著降低(P<0.05)；肠道组织的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性无显著性变化。

图4 不同的暴露时间对凡纳滨对虾各组织γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的影响Fig.4 Effects of different exposure time on γ-GCS activities in various tissues of Pacific white shrimp L. vannamei

3 讨 论

空气暴露是无水运输活虾期间的一种缺氧应激胁迫，这种缺氧应激胁迫易导致对虾组织中产生过多的活性氧自由基，而机体活性氧自由基的快速积累，超出其活性氧自由基的清除能力，此时对虾便处于氧化应激状态[9-10]，这也是甲壳类动物环境胁迫的毒性机制之一，严重时会威胁其存活[11-13]。由于不同甲壳动物的形态结构和生理代谢调节功能不同，在无水条件下存活时间差异很大，通常对虾类暴露在空气中时存活时间较短，而鳌虾和蟹类存活时间较长，这与其相对封闭的鳃室和鳃结构的进化密不可分[14]。在开始暴露于空气中到临近死亡的过程中，即甲壳动物在氧气充足到缺氧窒息的过程中，机体是否真正发生了氧化应激，此时，各组织中抗氧化防御系统如何变化？甲壳动物这方面的研究极度缺乏。

3.1 干露时间对凡纳滨对虾丙二醛含量变化的分析

丙二醛是脂质过氧化的主要分解产物，其含量的高低不仅可以间接反映活性氧自由基含量的多少，还可以反映组织细胞脂质过氧化的强度的大小或速率的快慢，被认为是衡量动物氧化应激程度的最常用和最经典的标志物[15-16]。据报道，当智利雪蟹(Paralomisgranulosa)暴露于空气6 h后，肝胰腺和肌肉中的脂质过氧化水平增加[17]。将体质量为10～11 g 的日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)放置干燥环境中进行暴露试验，结果显示其肝胰腺中丙二醛含量在胁迫3 h时显著增加，将其再次放入水中时，丙二醛水平降至正常值[5]。有研究表明，11 g凡纳滨对虾低温后空气暴露前期肝胰腺中丙二醛和活性氧自由基水平显著升高，暴露后期逐渐恢复至正常水平[18]。本试验结果表明，在空气中暴露不同时间显著地提高了凡纳滨对虾血液、肝胰腺及胃中的丙二醛质量摩尔浓度，肠道、心脏中的丙二醛质量摩尔浓度呈上升趋势，而肌肉中的丙二醛质量摩尔浓度无显著影响，与已有的研究结果一致。这表明，在空气暴露30 min过程中，凡纳滨对虾多种组织中脂质均发生了过氧化现象，表明各组织细胞均有不同程度的损伤。造成细胞脂质过氧化损伤可能是因为对虾暴露空气后引起氧化应激，细胞中活性氧自由基的过多积累而最终导致脂质的过氧化。

3.2 干露时间对凡纳滨对虾总抗氧化能力变化的分析

在正常状态下，细胞中会存在一定的活性氧自由基，因为活性氧自由基可以作为第二信使等发挥其生理功能，因此活性氧自由基存在对于组织细胞来说是必要的，但是过量的活性氧自由基会使生物大分子发生氧化反应，导致细胞功能丧失，甚至引起细胞凋亡或坏死。虾类会调节活性氧自由基的产生并使用抗氧化剂防御措施将活性氧自由基保持在适当的水平以控制氧化损伤程度[19]。总抗氧化能力的变化显示了机体内抗氧化酶系统及非酶系统对有害刺激的代偿能力及体内活性氧自由基的代谢情况，因此总抗氧化能力的大小常被用作评估机体抗氧化能力的重要性指标[20]。总抗氧化能力包括抗氧化酶(超氧化物歧化酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等)以及非酶抗氧化剂(谷胱甘肽、牛磺酸、抗坏血酸、维生素E、海藻糖、α-生育酚等)所具备的机体总体抗氧化酶活性[21]。在胁迫早期，总抗氧化能力的上升能反映出甲壳类动物在环境胁迫下总体对抗氧化的能力的提高。因环境因子而导致甲壳类动物总抗氧化能力改变的相关研究已有报道。如随着缺氧暴露时间增加，中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)血淋巴中总抗氧化能力逐渐降低[22]；13～14 g的凡纳滨对虾暴露在空气中其肌肉及肝胰腺组织总抗氧化能力显著降低[21]；而有学者研究表明，低温后空气暴露前期11 g的凡纳滨对虾肝胰腺中总抗氧化能力显著升高，暴露后期逐渐恢复至正常水平[18]。在本试验中，肝胰腺组织总抗氧化能力显著降低，而其他组织(心脏、肌肉、血淋巴、胃和肠道)均呈上升趋势。这些结果说明，环境因子的变化能够引起对虾组织的抗氧化反应，但具有一定的组织差异性。其中肝胰腺组织总抗氧化能力出现显著降低可能是因为肝胰腺具备高代谢率并具有解毒和吸收功能，在无水低温胁迫过程中更容易受到氧化应激引起抗氧化反应，从而具备更强的抵抗氧化损伤的能力[23],但严重缺氧对于对虾抗氧化功能来说是极为不利的。

3.3 干露时间对凡纳滨对虾总超氧化物歧化酶活性变化的分析

抗氧化酶系统是动物体普遍存在用于清除过多活性氧自由基的酶类，其中超氧化物歧化酶是细胞抗氧化酶系统中最常见、最有效的一种，它可催化超氧阴离子生成过氧化氢，而过氧化氢在过氧化氢酶的作用下进一步生成无毒的水分子[24]。低氧暴露、低氧运动可引发体内产生过量的活性氧自由基[25]。为了清除过多的活性氧自由基，抗氧化酶持续消耗，因此，表现出了酶活性的普遍降低。在通过填充氮气使氧气质量浓度达到0.5 mg/L的低氧环境胁迫4 h后，张口蟹(Neohelicegranulata)肌肉中的超氧化物歧化酶活性呈下降趋势[26]。据报道，13～14 g凡纳滨对虾肝胰腺中的超氧化物歧化酶活性在暴露于空气的40 min内逐渐增加[21]。而凡纳滨对虾血淋巴、肝胰腺和鳃中的超氧化物歧化酶活性在无水条件下时呈先升后降趋势并逐渐趋于稳定。已有研究结果显示，11 g的凡纳滨对虾的肝胰腺和血淋巴超氧化物歧化酶活性均随着暴露时间先升高后趋于稳定[18]。10 cm凡纳滨对虾在3.0×10-6低氧条件下肝胰腺中超氧化物歧化酶活性先增后降[27]。据报道，持续6 h的缺氧应激胁迫导致凡纳滨对虾肝胰腺中锰超氧化物歧化酶活性和转录本水平显著下降[28]。本试验结果表明，长时间暴露于空气中，肌肉和肝胰腺总超氧化物歧化酶活性显著降低，与上述胁迫应激研究结果一致。而血淋巴、心脏总超氧化物歧化酶活性变化趋势相反，长时间暴露于空气中，血淋巴、心脏总超氧化物歧化酶活性显著升高，说明血淋巴、心脏与肌肉、肝胰腺相比，总超氧化物歧化酶活性变化有一定的延迟。对中华绒螯蟹[29]的研究表明，在缺氧期间超氧化物歧化酶活性增加，这使其能够耐受缺氧环境并降低氧化应激的影响。这个过程被称为“氧化应激的准备”[30]。在本试验中血淋巴和心脏的结果相似。对肠道来说，在刺激最短的时间内，总超氧化物歧化酶活性显著升高，而后恢复正常水平，说明肠道总超氧化物歧化酶活性对于空气暴露刺激最为敏感，可以作为以后研究的首选对象。对比上述研究结果，本试验总超氧化物歧化酶活性变化与其并不完全相同，其原因可能与刺激条件、对虾规格和状态等有一定关系。

3.4 干露时间对凡纳滨对虾γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性变化的分析

谷胱甘肽的巯基供氢体,是存在于生命有机体中的一种特殊的三肽，它不参与蛋白质的合成，是细胞中广泛分布的天然活性氧自由基清除剂。在谷胱甘肽过氧化物酶等催化下，还原型的谷胱甘肽与活性氧自由基能发生反应生成氧化型的谷胱甘肽，以此来清除细胞内过多的活性氧自由基和过氧化物，从而保护细胞免受氧化损伤，维持组织结构的完整和正常功能的行使[31-32]。据报道，中华绒螯蟹经空气暴露后，血淋巴中谷胱甘肽过氧化物酶活性先升高后逐渐降低[22]。而10 cm的凡纳滨对虾在3.0×10-6低氧条件下肝胰腺中谷胱甘肽过氧化物酶活性先升后降[27]。在空气暴露试验中，谷胱甘肽过氧化物酶活性下调，这可能反映了持续缺氧抑制了蛋白质合成和代谢，导致转录特征普遍下降。一般动物能够通过自身储存的底物来合成谷胱甘肽，而谷胱甘肽连接酶(γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶)是合成谷胱甘肽的关键限速酶，能够决定细胞中谷胱甘肽的水平，因此γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶也是一种典型且敏感的抗氧化酶，对细胞的抗氧化能力起到重要的指示作用。对虾的研究上，对于γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的相关报道极为缺乏，因此，笔者对γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的变化进行了系统的检测，结果显示，肝胰腺、肠道和心脏中的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性显著降低，而血淋巴中的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性显著升高后恢复正常。这一结果说明，空气暴露对不同组织γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的影响具有组织特异性，并且空气暴露能够明显地诱导γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的变化，由此可以推测，细胞中谷胱甘肽的水平也会出现相应的变化，而这种改变正是细胞应对空气暴露这种环境刺激的一种策略。

通过不同抗氧化相关指标的检测，笔者发现，随着暴露时间延长，肝胰腺、血淋巴、心脏、肠道组织比胃、肌肉组织更容易受到氧化损伤，这与凡纳滨对虾肝胰腺抗氧化能力强于肌肉[21]的研究结果一致。相比之下，肝胰腺中丙二醛质量摩尔浓度、总抗氧化能力、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性、总超氧化物歧化酶活性变化最为显著且数值较高，而血淋巴总抗氧化能力和总超氧化物歧化酶活性最高，表明肝胰腺和血淋巴氧化应激程度相对较高。原因可能是甲壳类动物没有适应性免疫系统[33-34],它们仅通过先天免疫系统抵抗压力[35-36]。血淋巴在甲壳动物的先天免疫中起着重要作用，而肝胰腺参与消化、储存物质，脂质代谢，碳水化合物代谢，排毒和吸收过程[37]，它具有相对较高的代谢率，并且在空气暴露中更容易受到氧化应激的影响。

本试验结果表明，凡纳滨对虾不同抗氧化酶活性和抗氧化物质在不同时间段和不同组织之间的变化并不一致。其原因可能是：不同的抗氧化酶和抗氧化物质之间各自扮演着不同的角色，其作用并不相同，在同一时间内对刺激所做出的反应会有不同；另外，因对虾抗氧化功能具有一定的组织特异性，同一指标在不同组织间可能出现了作用延迟的现象，最后导致了各组织不同时间段抗氧化指标的差异。但总的来说，凡纳滨对虾各组织中的总超氧化物歧化酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性随着空气暴露胁迫均呈现下降趋势，与总抗氧化能力变化趋势基本一致，并与丙二醛质量摩尔浓度变化趋势相反，证实了空气暴露确实引起凡纳滨对虾产生氧化应激反应。

3.5 未来展望

目前，空气暴露对凡纳滨对虾影响方面的研究是行业热点问题，已有的研究结果显示，空气暴露能够引起对虾的免疫反应[38]，缺氧刺激会导致对虾细胞凋亡[6]。而这些结果均与对虾活性氧自由基产生和抗氧化能力密切相关[39]，因此对虾的抗氧化能力是潜在的抵抗力，增强对虾的抗氧化能力对于提高生长性能、抵抗应激具有重要意义。而空气暴露或者缺氧对凡纳滨对虾抗氧化系统影响的研究较为缺乏，这对于解决凡纳滨对虾干法运输是不利的。另外，对虾抗氧化功能的研究还主要集中在代谢水平方面，还应该向调控抗氧化功能的经典信号通路Keap1-Nrf2-ARE方向开展深入研究[40]。并且对虾上是否存在Keap1-Nrf2-ARE信号通路？对抗氧化系统起控制作用的信号通路是什么？这些问题仍需进一步的深入研究。针对于空气暴露或者缺氧刺激来说，最敏感的蛋白是缺氧诱导因子[41-42]，并且该蛋白的cDNA全长等分子基础信息相对全面[43]，因此，应将抗氧化功能与缺氧诱导因子、细胞免疫、细胞凋亡等结合起来研究，才能够清晰地诠释空气暴露或者缺氧对凡纳滨对虾的综合影响。

4 结 论

在本试验条件下，将凡纳滨对虾进行室温空气暴露能够明显地引起对虾各组氧化应激；不同组织对空气暴露刺激的响应具有组织特异性，其抗氧化能力变化趋势不同，其中肝胰腺、血淋巴、心脏和肠道相对敏感；短时间(5 min)的空气暴露对凡纳滨对虾组织抗氧化功能破坏较小，而长时间(30 min)的空气暴露能明显降低组织的抗氧化能力。