肝内胆管癌患者血清CXCL9和IFN-γ水平变化及其临床意义探讨

宋 雪，席子涵，李 婷，周 苗

肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)是原发性肝癌中较为常见的恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升的趋势，预后差，严重威胁患者的生命健康[1]。目前，ICC的发病因素尚未完全阐明，但学者们认为其发病与寄生虫感染、肝内胆管结石、病毒性肝炎、血管生成和免疫调节紊乱等有关。此外，临床仍缺乏有效评估ICC患者预后的指标[2-4]。因此，寻找与ICC发病有关且可有助于评估患者预后的标志物是关键。研究发现，前列腺癌趋化因子配体9(C-X-C motif chemokine ligand 9，CXCL9)表达失调，可能通过抑制T细胞细胞因子表达，从而促进前列腺癌的发病进程[5]。另外，干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)在肺腺癌患者中表达下调，也可能在疾病的发生发展过程中起重要作用[6]。本研究检测了ICC患者血清CXCL9和IFN-γ水平变化，并分析了检测的临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2012年1月～2017年1月我院收治的ICC患者63例，男40例，女23例；年龄为36～75岁，平均年龄为(58.66±12.36)岁。参考《美国肝胆胰学会共识声明》[7]有关ICC判定标准进行诊断。纳入标准：(1)经组织病理学检查确诊；(2)术前未进行过放化疗等任何抗肿瘤治疗。肿瘤<5 cm者20例，肿瘤≥5 cm者43例；TNM Ⅰ/Ⅱ期者47例，Ⅲ/Ⅳ期者16例；淋巴结转移者12例；低分化者30例，中/高分化者33例；脉管癌栓11例。排除标准：(1)合并肝、肾功能不全、其他恶性肿瘤；(2)失访者。另选择同期在我院健康体检者63例，男38例，女25例；年龄为35～77岁，平均年龄为(59.02±12.54)岁。ICC组与健康人男女性别比例和年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有研究对象或其家属签署知情同意书，本研究符合《赫尔辛基宣言》，并获得我院医学伦理委员会批准。

1.2 治疗方法 63例ICC患者均接受根治性肿瘤切除术，并清扫周围淋巴结。

1.3 血清CXCL9和IFN-γ水平检测 采用ELISA法检测(上海恒斐生物科技有限公司，货号：CSB-E11718h-1和江苏普诺生生物科技有限公司，货号：PK-EL-61806)，于冰箱中取出试剂盒内配套的标准品，配制成标准品溶液，检测各浓度标准品溶液的吸光度，绘制标准回归曲线。将血清解冻，平衡至室温，将血清加入酶标板中，设置3个复孔，每孔100μL；将酶标板放入37℃培养箱中，孵育20～30 min，每孔分别加入相应含有CXCL9 生物素工作液100 μL或IFN-γ生物素工作液100 μL，37℃孵育50～60 min，弃掉反应液，用PBS洗涤2次；每孔加亲和素-过氧化物酶复合物工作液100 μL，37℃孵育30 min，弃去反应液，用PBS洗涤3次；每孔添加显色液90 μL，37℃孵育20 min，每孔加入终止液10 μL，于Q3000型酶标仪(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)450 nm处检测各样本吸光度值。依据标准回归曲线计算血清CXCL9和IFN-γ水平。

1.4随访 采取电话/门诊随访，以ICC患者接受手术日期为随访起点，以死亡或随访截止至2020年1月为随访终点。

2 结果

2.1 两组血清CXCL9和IFN-γ水平比较 与健康人比，ICC患者血清CXCL9水平显著升高(P<0.05)，而血清IFN-γ水平显著降低(P<0.05，表1)。

表1 两组血清CXCL9和IFN-γ水平比较

2.2 不同临床和病理学特征ICC患者血清CXCL9和IFN-γ水平比较 不同TNM分期、有无淋巴结转移、不同分化程度的ICC患者血清CXCL9和IFN-γ水平差异显著(P<0.05)，而不同性别、年龄、肿瘤大小、有无脉管癌栓的ICC患者血清CXCL9和IFN-γ水平无显著性差异(P>0.05，表2)。

表2 不同临床和病理学特征ICC患者血清CXCL9和IFN-γ水平比较

2.3 不同血清CXCL9和IFN-γ水平的ICC患者预后比较 对63例ICC患者进行36个月的随访，结果死亡42例(66.7%)，生存21例(33.3%)；以ICC患者血清CXCL9水平为820.7 pg/mL为截断点，低水平者30例，高水平者33例，经Kaplan-Meier生存分析显示，血清CXCL9低水平的ICC患者术后36个月生存16例(53.3%)，显著高于CXCL9高水平组的5例(15.2%)。经卡方检验，两组生存率比较存在统计学差异(x2=12.448，P<0.001)；以ICC患者血清IFN-γ水平为18.7 ng/L为截断点，低水平者34例，高水平者29例，IFN-γ低水平组术后36个月生存5例(14.7%)，显著低于高水平组的16例(55.2%)，两组生存率存在统计学差异(x2=10.554，P=0.001)。

3 讨论

ICC是一种消化道恶性肿瘤，其起病隐匿，早期易发生淋巴结转移，对放化疗敏感性低，多数患者治疗预后极差，对人类健康构成极大的威胁[8-10]。因此，寻找ICC发病相关因素，并及早干预，对改善患者预后有一定的积极意义。

趋化因子是一类蛋白多肽小分子，包含CC、C、C3XC4、CXC等4个亚族。CXC类趋化因子在肿瘤发病过程中发挥重要的作用，包括调控肿瘤有关血管生成、白细胞浸润、刺激宿主对肿瘤的免疫应答、以旁分泌/自分泌方式影响肿瘤细胞增殖和调节肿瘤细胞运动等[11，12]。CXCL9属于趋化因子CXC亚族，其基因位于4q21染色体上，可调节细胞生长、凋亡，介导血管稳定，影响免疫调节，与结直肠癌、胃癌、ICC等癌症发展过程相关[13-15]。近期研究发现，CXCL9在早期乳腺癌发病过程中水平异常升高，其与乳腺癌患者不良预后及肿瘤浸润有关，CXCL9可作为判定乳腺癌患者预后的生物学标志物[16]。另外，CXCL9在胰腺癌中呈高表达，其可能与其参与趋化免疫细胞作用，与患者不良预后相关，有望成为治疗胰腺癌的潜在靶标[17]。以上研究证实，CXCL9水平异常可能与多种肿瘤的病变过程密切相关。Fukuda et al[18]研究认为CXCL9可能通过调节ICC肿瘤浸润性自然杀伤细胞，进而影响患者预后，因此认为CXCL9可作为评估ICC患者预后及治疗ICC的生物学靶点。在本研究中ICC组患者血清CXCL9水平显著高于健康组，与其在胰腺癌中的表现趋势一致[16]，提示CXCL9可能在ICC发生发展过程中具有重要的作用，推测CXCL9作为趋化因子家族成员之一，其水平升高可能促进肿瘤细胞浸润、细胞增殖，影响机体免疫应答或血管生成等，进而促进ICC的发展，但具体作用机制仍需进一步探究证实。

IFN-γ主要是由自然杀伤细胞和活化的T细胞分泌的细胞因子，人IFN-γ基因位于第12号染色体，其可抑制肿瘤细胞增殖、转移、血管生成，影响肿瘤微环境，促使肿瘤细胞凋亡。另外，IFN-γ可通过增加巨噬细胞膜表面Fc受体表达水平，进而增加巨噬细胞因子合成抑制因子，从而抑制活化的Th1淋巴细胞产生IFN-γ和白细胞介素-2，抑制免疫应答，与多种肿瘤病理学发展关系密切[19-21]。研究发现，IFN-γ在胃癌患者血清中水平降低，与淋巴结转移、临床分期显著相关，其可能参与并影响胃癌病理学发展结局[22，23]。在本研究中ICC患者血清IFN-γ水平显著低于健康人，提示IFN-γ可能在ICC发病过程中起重要作用，究其原因，一方面，低水平的IFN-γ降低了机体对肿瘤细胞增殖、转移、血管生成的抑制作用，对肿瘤细胞的促凋亡作用降低，进而促进ICC发生和发展；另一方面，Th1型细胞主要介导细胞免疫，Th2型细胞主要介导体液免疫，且机体对肿瘤的免疫调节以Th1型细胞为主。若发生免疫功能偏移，形成Th2型细胞，肿瘤细胞易发生免疫逃逸，促进肿瘤的发生和发展，故低水平IFN-γ抑制自然杀伤细胞分泌IFN-γ，降低自然杀伤细胞的杀伤性，不利于Th1细胞分化，反而能促进Th2型细胞形成，影响免疫平衡，促进肿瘤细胞发生免疫逃逸，促进ICC病理学生长和发展，但仍需进一步探讨其作用机制。

在本研究中ICC患者血清CXCL9和IFN-γ水平与肿瘤TNM分期、淋巴结转移、分化程度相关，进一步提示CXCL9和IFN-γ与ICC患者临床和病理学特征有关，两者均可能在ICC发生发展过程中具有重要作用。本研究显示，CXCL9低水平组和IFN-γ高水平组ICC患者术后36个月生存率分别显著高于CXCL9高水平组或IFN-γ低水平组，提示ICC患者血清CXCL9和IFN-γ水平异常变化与患者不良预后密切相关，两者有望成为评估ICC预后的标志物。

综上所述，ICC患者血清CXCL9水平显著上调，而血清IFN-γ水平显著降低，两者均可能参与并影响ICC患者发病的进展，检测血清CXCL9和IFN-γ水平有利于临床评估ICC患者预后情况。但本研究未深入探究CXCL9和IFN-γ在ICC患者的变化规律，且样本较少，易造成检测误差，后期将扩大研究样本量进行深入研究。