非酒精性脂肪性肝病动物模型研究进展*

张译之，张晓慧 综述，陈 煜 审校

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease ，NAFLD)是指与过量饮酒无关的，以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征[1]。NAFLD疾病谱包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化、NAFLD相关性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，疾病过程通常伴随脂肪增加、体质量增加、胰岛素抵抗、血脂异常，组织学可见肝脂肪变性、小叶炎症、肝细胞气球样变、细胞周围纤维化等。全球NAFLD的患病率逐年增高。目前，亚洲患病率为27%[2]，尚缺乏用于NAFLD的有效药物，也缺乏精准的方法识别NAFLD和NASH危险人群，还缺乏模拟疾病和测试新药的最佳体外模型，因此构建合适的肝脂肪变性实验模型具有重要的意义。

1 动物模型

NAFLD动物模型可分类为遗传模型、营养模型、遗传和营养因子的组合模型[3]。

1.1 基因敲除或基因突变模型 1) ob/ob 小鼠和 db/db 小鼠模型。db/db小鼠是常染色体隐性糖尿病基因(db)的纯合子。该基因编码瘦素受体(Ob-Rb)的点突变，导致瘦素信号缺陷。db/db小鼠的瘦素水平无异常，但却伴有瘦素抵抗。这些小鼠摄食量多，伴严重的肥胖、糖尿病和高胰岛素血症，肝脏病理表现为肝脂肪变性(大泡性)[4]。与db/db小鼠不同，ob/ob小鼠的瘦素编码基因(ob基因)突变，表现为瘦素合成障碍。这些小鼠同样存在超重、高摄食状态、高胰岛素血症、高糖血症和胰岛素抵抗，病理也存在自发性肝脂肪变性。早在1997年[5]，人们就发现ob/ob小鼠在正常对照饮食中不会自发产生炎症，如果给ob/ob小鼠第二次“打击”，如注射细菌脂多糖，可诱发脂肪性肝炎。同样地，给db/db小鼠缺乏蛋氨酸和胆碱(MCD)饮食干预或摄入反式脂肪，可以在NAFLD的基础上诱发NASH。不同的是，ob/ob小鼠有抵抗肝纤维化的能力，因为在肝纤维化过程中需要瘦素的参与[6]；2)PTEN基因敲除小鼠。人类第10号染色体缺失的编码与磷酸酶和张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10, PTEN)是一种重要的抑癌基因，它影响PI3K/Akt/mTOR途径和胰岛素信号途径，是肝脏脂肪生成、葡萄糖代谢和肿瘤发生的重要介质[7，8]。肝特异性PTEN基因敲除的小鼠发展为NAFLD，对胰岛素高敏感[9]。肝脏组织形态学不只可见大脂滴性脂肪肝、肝细胞肿胀、小叶内炎性细胞漫润等酷似人NASH的病理组织学改变，而且完全可以重现“脂肪肝-脂肪性肝炎-肝纤维化-肝癌”的自然经过。研究表明66%肝细胞特异性PTEN基因敲除小鼠在74～78周龄时可发展为自发性肝癌[10]。因此，该模型常用来探索NASH以及相关HCC进展的机制；3)SREBP-1c转基因小鼠。胆固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol response element -binding protein 1c，SREBP-1c)是一种转录因子，影响脂质代谢。SREBP-1c转基因小鼠表现为肝脂肪变性、胰岛素抵抗，小叶炎症、肝细胞气球样变和细胞周围纤维化[11]。然而，该模型白色脂肪组织质量减少，循环瘦素水平低，因此其应用受到了与ob/ob小鼠相似的限制。此外，该小鼠在正常饮食20周后，会出现静脉及细胞周围纤维化，但整个疾病过程中没有肥胖的发生[11]。

1.2 营养、药物诱发模型 1)高脂饮食模型。高脂饮食(high-fat diet，HFD)模型所构建的NAFLD模型可以较好地反映人类NAFLD肝脏组织病理学。经典的HFD饮食能量来源组成为脂肪占比71%、碳水化合物11%、蛋白质18%。给予雄性C57BL/6[12]小鼠HFD喂养16周，结果HFD小鼠出现肝脂肪变性、TG水平升高、肝细胞气球变，并出现胰岛素抵抗。SD大鼠对高脂饮食更敏感，且雄性大鼠更易发生肝细胞脂肪变。Solinas et al[3]用雄性SD大鼠HFD饮食1～4周，与人脂肪肝的肝脏组织进行形态学比较，结果发现HFD动物模型与人类脂肪肝的相应阶段有着密切的相似性。2016年，Asgharpourde et al[13]给予HFD动物不限制葡萄糖和果糖，可依次发展为NAFLD、NASH、进行性纤维化和HCC。然而，NASH的形成需要16周，晚期纤维化的形成需要36周。此外，肝癌的发生频率远高于人类；2)高胆固醇饮食(high cholesterol diet，HCD)模型。饮食中的胆固醇是动物模型[14]NAFLD进展为NASH的关键因素。单用HCD喂养的小鼠胰岛素水平升高，但肝质量、甘油三酯水平和血清丙氨酸氨基转移酶水平仅轻微升高[15]。然而，当高胆固醇与高脂肪结合时，有更明显的NASH表现：小鼠体质量增加、肝脏脂质积聚增加、血清ALT水平升高、脂联素水平降低、炎症增加和纤维化，并且这些特征比在HFD或HCD小鼠中更为明显。同样地，高胆固醇、高胆酸盐饮食小鼠也表现出脂肪变性、炎症、肝细胞气球样变和纤维化[16, 17]。有研究表明，膳食胆固醇降低脂肪酸的VLDL合成和β-氧化，增加细胞凋亡和肝脏氧化应激[18]；3)高果糖饮食模型。 人类从富含果糖的食物中摄入大量热量，影响了肥胖和NASH的发展[19]。C57BL/6小鼠喂食HFD或高脂高果糖(high-fat high-fructose，HFHF)饮食，结果发现两组小鼠的体质量增加、体脂含量、胰岛素抵抗和肝脂肪变性相似，HFHF小鼠肝脏巨噬细胞数量、转化生长因子水平、肝氧化应激水平和胶原沉积增加[19]。在最近的一项研究中，给予Cxcr3基因敲除和C57BL/6野生型小鼠类似的HFHF饮食，Cxcr3基因敲除小鼠的肝脏组织学得到改善，坏死性炎症水平降低，脂质过氧化减少，表明Cxcr3在HFHF小鼠模型NASH形成中起着关键作用[20]；4)蛋氨酸-胆碱缺乏饮食(methionine choline deficiency ，MCD)模型。食物中缺乏蛋氨酸及胆碱酸会影响到肝脏的β氧化和极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein ，VLDL)的转运，导致肝内脂质积聚。在一项研究中[21]，实验人员给予不同品系的大鼠MCD 饮食喂养4周，结果发现Wistar雄性大鼠脂肪变性最严重。雄性C57/BL6小鼠的炎症和坏死最为严重，脂质过氧化和超微结构损伤，并最接近NASH的组织学特征。MCD模型的肝损伤发生迅速，但恢复正常饮食后是可逆的。然而，该模型的代谢特征与患者相反：胰岛素、瘦素和葡萄糖水平降低。为解决上述问题，有学者联合应用胆碱不足(CD)、HFD构建NAFLD相关动物模型，该饮食为20%蛋白质，35%碳水化合物和45%脂肪，不添加胆碱。实验动物在6～12周发生NASH，12个月时，可诱导出NAFLD相关HCC[22]。

2 肝脂肪变性细胞模型

2.1 FFA诱导的细胞模型 人HepG2肝癌细胞株与肝细胞生物学功能相似，但能更好地耐受脂毒性，常用于研究肝细胞脂肪变。游离脂肪酸(free fatty acid ，FFA)可以合成TG，TG含量过高会引起肝脂肪变性。因此，FFA常用于诱导建立脂肪变性细胞模型。Zhang et al[23]采用25%胎牛血清和0.1%中/长链脂肪乳作用一段时间后，续贯用0.1 mmol/L FFA作诱导液继续作用细胞，成功建立了脂肪变性模型。实验室常用的细胞模型主要缺点是不能支持长时间培养、细胞易失去正常形态、脱离体内环境(如枯否细胞、肝星状细胞等)的影响，并不能很好地反映肝细胞的表型和功能。Kozyra et al[24]用人原代肝细胞构建的3D球面细胞模型克服了这些缺点。该模型不仅维持了细胞形态,而且保存了肝细胞在病理状态下的胰岛素抵抗。

2.2 果糖诱导的细胞模型 研究发现，果糖水饲养C57BL/6小鼠8周即出现明显的肝脏脂肪变，提示人类NAFLD的普及与甜味剂的大量使用及含糖饮料的摄入相关[25]。选择人正常肝细胞系LO2细胞，以不同浓度的果糖处理24 h诱导细胞脂肪变性，并与FFA干预相比较，结果发现，4 mmol/L果糖作用于LO2细胞24 h后，即可上调肝细胞脂肪合成基因，从而导致肝细胞脂肪变。果糖诱导模型和经典的FFA诱导模型结果显示，果糖可以显著增加LO2细胞内脂质合成相关蛋白的表达，说明果糖可能主要影响脂质合成源头，从而导致肝细胞内脂质沉积[26]。Kozyra用果糖作用3D模型时也岀现了脂肪变性，并呈时间依赖关系。当撤去脂肪变性培养液或加入治疗性药物后，脂肪变性缓解[24]。

2.3 基于细胞外基质支架构建3D肝脏NAFLD模型 肝细胞在2D环境中培养一段时间，其增殖能力和部分生物学功能丧失， 而在3D环境中培养时，肝细胞的增殖能力和生物学功能与2D环境相比大大提升[27]。因此，许多研究者探索应用生物材料构建细胞培养的三维微环境。Yamada et al[28]构建了一种由3T3细胞-肝细胞-3T3 细胞构成的三明治样类肝索结构的凝胶纤维模型，该模型的肝细胞与传统的平面培养相比，肝细胞特异性蛋白表达增多，白蛋白和尿素合成能力增强。Rennert et al[29]在此基础上，尝试将更多种类的细胞(如内皮细胞、外周血单核细胞、HepaRG 细胞、星状细胞)植入“三明治”模型共培养，以期更接近正常的肝索结构。近年来，3D打印技术也应用于三维支架的构建，将诱导体系与细胞混合喷涂，叠加其他种类细胞、生长因子、信号分子等，在计算机指令下打印，形成有生理功能的活体器官。

蛋白质组学分析发现，肝脏微环境的细胞外基质蛋白种类繁多[30]，因此事实上肝脏来自细胞外基质的信号远比2D细胞培养基质成分复杂得多。随着细胞培养技术、肝脏组织工程技术的发展，出现了一些新的方法制备人工肝脏。肝脏组织工程的核心首先是通过肝脏脱细胞获得理想的支架材料，支架保留了细胞外基质，去除了细胞、遗传物质，降低了免疫原性。组织工程的另一核心是生物支架的再细胞化，灌注的细胞可为肝细胞、干细胞、内皮细胞等，这样即可获得具有功能的组织工程肝脏。Uygun et al[31]在2010年成功将肝细胞种植到脱细胞肝脏支架上，并检测再细胞化后肝脏白蛋白的分泌、尿素合成等功能。Wu[32]将人肝细胞株HepG2种植到肝基质支架，灌流完全培养基，使细胞形成功能性肝组织。随后,用高脂培养基灌注该组织，建立了与NAFLD肝脏相似的组织工程脂肪肝(tissue engineering fatty liver，TEF)模型。培养8天后发现TEF脂肪积累比对照组多2倍，脂肪酸代谢受损，与NAFLD相关的PDK4、CYP2E1、CYP7A1基因均上调，CYP3A4代谢活性明显受损。TEF肝随后用二甲双胍处理，结果发现与NAFLD患者使用二甲双胍有相似的效果。由此可见，TEF肝脏为研究NAFLD的发展过程和药物效应提供了一个稳定和可重复的模型。但是,这一模型缺乏肝脏非实质细胞与肝细胞相互作用，细胞外基质中缺乏许多重要的影响因子。

3 小结

NAFLD理想的模型应有脂肪增多、体质量增加、胰岛素抵抗、血脂异常并全谱表达NAFLD组织学，还应与纤维化进展有关。然而，在各种模型中，诱导脂肪变性相对容易，但完全转化为人类NAFLD-NASH-肝纤维化-HCC的疾病过程仍然是一个挑战。

2D体外脂肪变性细胞模型因其实验周期短、重复性好、实验条件易于控制。HFD模型可以反映人NAFLD的疾病演变过程,且造模停止后病变也不会很快好转，为试验中药物干预提供窗口。但该模型造模时间较长，目前要解决时间成本问题，高脂饲料配方的尚有改良的余地。研究显示饲料中脂肪含量越高，小鼠体质量和肝质量越高，肝脏脂肪变性程度越高[33]。对于遗传学模型如瘦素及瘦素信号通路缺陷模型，这种突变在肥胖人群中并不普遍，与遗传问题相关的脂肪变性病例也并不常见[34]。此外，由于代谢背景的不同，遗传模型显示出不同的肝细胞损伤[35]。目前，尚没有一种模型能在完美复制人类疾病和时间成本上实现双赢，但组织工程肝脏模型或许可以将这一目标变为可能：它在一定程度上结合了2D模型和传统动物模型的优势，目前我们需要克服的障碍是解决在单纯性脂肪变性的基础上脂质过氧化产物在肝细胞中积聚并伴随炎性细胞浸润和/或胶原沉积(如纤维化)而引起的细胞损伤。这种反应是NAFLD进展为肝纤维化、肝硬化的必由之路。因此，我们需要利用不同的实质细胞和非实质细胞的共培养来改善我们的模型，模拟NAFLD患者肝脏中实际存在的细胞-细胞、细胞-因子相互作用，从而创造更精确的组织三维模型。

通过不断开创新的造模方法，使动物模型、细胞模型能更加符合人类NAFLD的疾病的特点，更加迎合研究者的意图，提高模型的重复性及稳定性，为人类早日认识NAFLD的发生机制及获得临床干预提供可能。