四川黑茶活性成分、抗氧化能力及品质评价

朱柏雨 夏 陈 罗棵濒 朱永清 唐晓波 陈 建

(1. 四川省农业科学院农产品加工研究所，四川 成都 610066；2. 四川大学公共卫生学院，四川 成都 610044；3. 四川省农业科学院茶叶研究所，四川 成都 610066)

茶叶中富含多种天然活性物质，包括茶多酚、生物碱、氨基酸和茶色素等[1]，其中茶多酚是茶叶中发挥生物活性的重要物质[2]。研究表明，茶多酚具有抗炎[3]、抗癌细胞增殖[4]、抗心血管疾病[5]和抗糖尿病[6]等作用。此外咖啡碱和茶碱等物质也是茶叶中重要的呈味物质和活性成分，具有强心、促进代谢[7]、利尿[8]、助消化[9]等功效。黑茶主产于四川、湖南、湖北、云南、广西等地[10]，是由茶树的鲜叶或成熟的新梢经杀青、渥堆、干燥等工艺制成[11]，原料一般较为粗老，儿茶素化合物含量通常低于嫩叶[12]。黑茶的渥堆是加工过程中的关键工艺，该工艺会发生氧化还原、美拉德反应等化学变化，这些变化可能促使茶多酚单体相互转化及分解，且不同的渥堆工艺生产的黑茶中茶多酚等功效物质可能有巨大差异[1]。曹永等[13]以湖南产区的天尖茶、茯砖茶和百两茶，云南的普洱茶以及广西的六堡茶为原料，考察了不同产区黑茶的简单儿茶素(表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素)和酯型儿茶素(表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯)含量，结果显示天尖、茯砖和百两茶提取物中儿茶素的总量高于普洱茶和六堡茶，酯型儿茶素含量则以天尖茶和百两茶占优。王斌等[14]分析了26种安化黑茶水溶性成分，并与干燥未加工的茶叶及新鲜茶叶作对比。结果表明，26种安化黑茶的没食子酸、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、咖啡碱、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、儿茶素没食子酸酯含量差异较大，与新鲜茶叶对比后发现除了咖啡碱外，其他化合物的含量均存在显著下降的情况，部分物质下降至1/20以下。刘婷婷等[15]研究发现黑茶在发酵过程中，其主要品质成分及生物酶活性均存在显著变化。随着黑茶发酵程度的不断加深，茶多酚、儿茶素、茶褐素、纤维素、原果胶、蛋白质、氨基酸、可溶性糖含量均在渥堆工艺中下降，其含量降幅分别为69.2%，43.7%，52.4%，9.6%，60.0%，62.3%，66.2%，37.2%，多酚氧化酶、过氧化物酶、纤维素酶、果胶酶活性分别提高了246%，371%，371%，223%，咖啡碱含量则无显著变化。

四川黑茶历史悠久，早在乾隆年间就分为“南路边茶”和“西路边茶”，但目前关于四川黑茶中茶多酚和黄酮及功效的研究较少，同时对于市售四川黑茶的品质评价也未见报道。因此研究拟对26种市售四川黑茶产品进行茶多酚和咖啡碱含量分析，通过自由基清除试验评价其抗氧化能力，并以相关性及主成分分析对市售26种四川黑茶(S1～S26)进行品质评价，以期为四川黑茶研发、生产和质量控制提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

26种黑茶：四川市售；

没食子酸(GA)、没食子儿茶素(GC)、儿茶素(C)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、儿茶素没食子酸酯(CG)标准品：北京索莱宝科技有限公司；

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)标准品：上海源叶生物科技有限公司；

咖啡碱(CAF)标准品：成都普菲德生物技术有限公司；

甲醇、乙腈：色谱纯，美国MREDA公司；

甲酸、福林酚、芦丁、水溶性维生素E、过硫酸钾、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：分析纯，成都市科龙化工试剂厂；

试验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

高速万能粉碎机：FW-100型，北京科伟永兴仪器有限公司；

数控超声波清洗器：KH2200DE型，昆山禾创超声仪器有限公司；

台式低速离心机：TD-4Z型，四川蜀科仪器有限公司；

酶标仪：ELX-800型，美国伯腾仪器有限公司；

高效液相色谱仪：1290型，美国Agilent公司；

优普系列超纯水机：UPC-1-10T型，成都超纯科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑茶多酚单体及生物碱含量分析

(1) 对照品的制备：单体酚与咖啡碱对照品20.0 mg，以甲醇溶解定容至5 mL，以二倍稀释法制备不同浓度的对照品溶液，冷藏备用。

(2) 样品的制备：将供试样品粉碎过筛，精密称取供试黑茶1.000 0 g于锥形瓶中，加入80%甲醇8 mL，40 ℃超声30 min后离心，收集上清液至25 mL容量瓶，残渣再以同样方法重复提取2次，合并3次提取液，定容备用。

(3) 色谱条件：采用梯度洗脱，Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；检测波长280 nm；柱温35 ℃；流速0.3 mL/min；进样量1 μL；流动相A为1%甲酸—水溶液，B为乙腈，洗脱条件：0～2 min，5%～10% B；2～10 min，10%～20% B;10～15 min，20%～40% B；15～17 min，40%～70% B；17～20 min，70%～95% B。

(4) 多酚单体及生物碱含量计算：经HPLC分析后，根据供试品各化合物峰面积及标准曲线按式(1)计算含量。

(1)

式中：

W——含量，mg/g；

C——样品质量浓度，μg/mL；

D——稀释倍数；

V——样品体积，mL；

m——样品质量，g。

1.3.2 总多酚(TPC)含量分析 采用福林酚法[16]，按式(1)计算TPC含量(以没食子酸当量计)。

1.3.3 总黄酮(TFC)含量分析 参照宋莹等[17]的方法，并按式(1)计算TFC含量(以芦丁当量计)。

1.3.4 抗氧化活性分析

(1) ABTS自由基清除能力：参照夏陈等[18]的方法，以水溶性维生素E为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，据标准曲线计算ABTS自由基清除力。

(2) DPPH自由基清除能力：参照邓俊琳等[19]的方法，以水溶性维生素E为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，据标准曲线计算DPPH自由基清除力。

1.4 数据处理与分析

所有数据均为3次重复取平均值，使用Microsoft Excel 2016进行数据整理并通过SPSS 20.0采用Turkey方法对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 四川黑茶活性成分含量

对照品和样品的HPLC图谱如图1和图2所示。由图1可知，10个对照品在20 min内均得到较好的分离且峰形较好，26个样品色谱图中的10个目标物的保留时间与对照品色谱图一致。

1. GA 2. GC 3. ECG 4. EC 5. EGCG 6. ECG 7. CG 8. C 9. EGC 10. CAF

图2 样品HPLC图谱

以各对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标制图得标准曲线回归方程如表1所示，10个目标物的回归方程R2在0.998 7～0.999 9，表明各回归方程在其线性范围内线性关系良好，可以用于各物质含量计算。

表1 回归方程及线性范围

2.1.1 GA含量 由表2可知，26个黑茶样品中GA含量差异较大，其中S21的GA含量显著高于其他样品(P<0.05)，而S11的GA含量最低。已有研究[20]表明，绿茶中GA含量大多低于1.00 mg/g，试验的26个样品中有25个样品的GA含量高于1.00 mg/g，表明茶叶经过发酵、渥堆、干燥等加工后能够显著提高GA含量，可能是在发酵等加工过程中的酯化儿茶素经过微生物作用、酶转化以及美拉德反应的共同作用下降解形成GA等物质[21]。

表2 四川黑茶GA含量†

2.1.2 GC、GCG、C、EGCG、ECG含量 26个样品中GC、GCG、C、EGCG、EGC 5个多酚单体含量差异较大(表3)。与绿茶[22]相比，黑茶的GC和GCG含量均相对较高，但C、EGCG和EGC含量则远低于绿茶。黑茶在渥堆及干燥过程中由于温度升高使GC和GCG含量升高，而C、EGCG和EGC的含量下降。有研究[23-24]表明，儿茶素类化合物会发生个体异构化，尤其是在较高的温度下更明显。随着温度的升高，部分儿茶素类化合物的含量减少，而其异构体含量增加，部分儿茶素类化合物从上位结构(EGC和EGCG)变化为非上位结构(GC和GCG)[25]。因此四川黑茶C、EGCG、EGC含量较绿茶有所下降，而GC、GCG的含量升高。

表3 四川黑茶GC、GCG、C、EGCG、ECG含量†

2.1.3 EC、ECG、CG、CAF含量 已有研究[20]表明，绿茶中EC含量在0.64～10.20 mg/g，ECG含量在2.18～13.40 mg/g。由表4可知，26个黑茶样品中的EC和ECG含量均低于绿茶，是由于黑茶在制作中需经过渥堆、发酵等工艺步骤，在氧化酶类(多酚氧化酶、过氧化物酶等)的作用下黑茶中几乎所有简单儿茶素(C、EC、EGC)和酯儿茶素(ECG、EGCG)含量显著降低，从而形成黑茶独有的颜色、风味和香气[26]。与其他单体酚相比，26个样品中的CG含量均处于较低的水平，而且各样品间的CG含量差异较大。所有供试品中咖啡碱含量占10种化合物总量24.50%以上且与绿茶[22]相比差异不大，表明咖啡碱性质稳定，在黑茶加工过程中不易受温度、发酵及氧化影响[27]。

表4 四川黑茶EGC、CAF、EC、CG含量†

2.2 黑茶总多酚含量

通过福林酚法，以没食子酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，制图得总多酚标准曲线：y=0.001 8x+0.042 6，线性范围2.34～300.00 μg/mL，其R2=0.999 1，表明在该范围内，线性关系良好，可用于总多酚含量计算。

黑茶中含有大量的多酚类化合物，主要以游离或结合的方式存在，其能够发挥降血脂、防止血栓和动脉硬化的形成。由表5可知，26个黑茶样品中的总多酚含量差异较大，其中S23总多酚含量为S11总多酚含量的10倍以上。多酚是一类在同一个苯环上有多个酚羟基取代的芳香羧酸类化合物，由于其含有多个酚羟基取代，因而结构不稳定[28]，在一定的光照、水分、温度、酶及酸碱条件下易发生开环反应而使其降解或异构化[29]。黑茶的渥堆、发酵等工艺实际上是一个氧化还原过程，因而不同生产厂家、不同工艺条件的黑茶样品的总多酚含量不尽相同。

表5 四川黑茶总多酚含量†

2.3 黑茶总黄酮含量

总黄酮的标准曲线为y=0.001x+0.051 7，线性范围0.98～500.00 μg/mL，其R2=0.999 1，表明在该范围内，线性关系良好，可用于总黄酮含量计算。

由表6可知，26个四川黑茶样品的总黄酮含量差异较小，维持在相对稳定的水平内。有研究[30]表明，黄酮类化合物在50 ℃以下、光照、弱酸及中性条件下均保持良好的稳定性。黑茶在渥堆过程中，其温度多在45 ℃以下[31]，因而能够保证黄酮类化合物不被降解，而黄酮类化合物含量差异可能是由其原料差异所致。

表6 四川黑茶总黄酮含量†

2.4 抗氧化活性

2.4.1 ABTS自由基清除能力 以水溶性维生素E的质量浓度(μg/mL)为横坐标，吸光值为纵坐标，制图得标准曲线回归方程：y=-0.006x+0.473 5，线性范围1.48～47.50 μg/mL，其R2=0.997 5，表明在该范围内，线性关系良好，可用于四川黑茶ABTS自由基清除计算。

由表7可知，26个样品的ABTS自由基清除能力差异较大。相关性分析结果表明，ABTS自由基清除能力与GA、GC、CAF以及TPC、TFC含量存在一定的相关性(表9)，由于黑茶的渥堆、发酵等加工过程中的美拉德反应及氧化还原反应对这些活性物质的含量均存在较大的影响，因此不同样品间ABTS自由基清除能力的差异也可能是由加工工艺不同所致。

表7 四川黑茶对ABTS自由基清除能力†

2.4.2 DPPH自由基清除能力 以水溶性维生素E的质量浓度(μg/mL)为横坐标，吸光值为纵坐标，制图得到DPPH自由基清除回归方程为y=0.942 8x-0.420 2，线性范围：13.00～104.00 μg/mL，其R2=0.997 0，表明在该范围内，线性关系良好，可用于四川黑茶DPPH自由基清除计算。

由表8可知，26个样品的DPPH自由基清除能力差异较大，显著性分析结果表明黑茶的DPPH自由基清除能力与单体酚、CAF、TPC和TFC含量均存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)的正相关(表9)，而黑茶的制作工艺同样会对这些物质的含量产生较大的影响，从而导致样品间DPPH自由基的清除能力不尽相同。

表8 四川黑茶对DPPH自由基清除能力†

2.5 相关性分析

如表9所示，简单儿茶素(C、EC、EGC)和酯儿茶素(EGC、GCG、EGCG)之间均存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)的相关性。四川黑茶样品的DPPH自由基清除能力与GA和EGCG含量呈显著正相关(P<0.05)，与其他单体化合物、总多酚及总黄酮含量呈极显著正相关(P<0.01)。ABTS自由基的清除能力与GA、GC和CAF含量呈极显著正相关(P<0.01)，与其他单体化合物无显著的相关性，表明抗氧化活性与多酚的含量以及种类有关。

表9 四川黑茶中单体酚、咖啡碱、总多酚、总黄酮和抗氧化活性的相关性†

2.6 主成分分析及综合评价

对26个四川黑茶样品的9个单体酚、CAF、TPC和TFC含量共计12个成分利用SPSS进行主成分分析(PCA)，结果见表10。经分析提取EGCG、C、TPC 3个主成分进行四川黑茶样品最终的综合评价(表11)。结果显示S16、S23、S19 3个四川黑茶的综合得分分别为7.44，6.66，3.85。因此当以EGCG、C、TPC 3个成分作综合评价，S16、S23、S19 3个四川黑茶更为优质。

表10 四川黑茶的单体酚、咖啡碱、总多酚和总黄酮的主成分分析结果

表11 四川黑茶综合评价得分及排名

3 结论

杀青、渥堆、干燥等过程中，四川黑茶的简单儿茶素、酯儿茶素以及总多酚含量均存在显著降低的现象，而总黄酮、咖啡碱的含量变化较小，与前人[14]对其他产区黑茶的分析结果相近。此外研究发现四川产区内的黑茶活性成分含量差异较大，产品品质参差不齐，可能是由于黑茶产品的生产原料、生产工艺及贮藏条件等多种因素导致，这也从侧面反映四川黑茶的生产工艺及质量标准不统一。研究仅对四川市售的26个黑茶进行了活性成分及抗氧化能力分析，并未结合其生产工艺，因此有必要将黑茶品质与其生产工艺相结合进行深入研究，建立黑茶生产从原料到最终产品的规范化标准。