生姜泻心汤高效液相色谱指纹图谱的建立

章从恩，王焕君，于小红，张学强，李 月，赵奎君，马致洁

(首都医科大学附属北京友谊医院中药剂科，北京 100050)

生姜泻心汤是临床常用的经典方剂，出自《伤寒论》第157条“伤寒汗出解之后，胃中不和，心下痞鞕，干噫食臭，胁下有水气，腹中雷鸣下利者，生姜泻心汤主之”[1]。生姜泻心汤由半夏泻心汤减干姜二两，加生姜四两而成，其原方组成为生姜(四两)、半夏(半升)、人参(三两)、黄芩(三两)、甘草(三两，炙)、黄连(一两)、干姜(一两)和大枣(十二枚，劈)，共8味药材。方中重用生姜，取其和胃降逆、宣散水气而消痞满；配合黄连、黄芩、半夏和干姜辛开苦降、散结消痞；人参、大枣等补益脾胃；故能治水热互结于中焦、脾胃升降失常所致的痞证[2-4]。目前，生姜泻心汤在临床上的应用非常广泛，主要被用于治疗肠胃炎[5-6]、消化不良[7-8]、呕吐[9-10]、结直肠癌[11]和泄泻(腹泻)[12-14]等症，其治疗消化系统疾病的疗效确切[6,15]。目前对于生姜泻心汤的研究主要集中在临床应用及药理药效方面，对于其质量控制方法尤其是色谱指纹图谱方法未见报道，亟待建立完善的生姜泻心汤质量控制方法，为其临床应用及药理药效研究提供参考。本研究通过高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)建立生姜泻心汤的色谱指纹图谱，为生姜泻心汤的质量控制提供科学参考。

1 材料

1.1 仪器

液相色谱串联离子阱飞行时间质谱(LC-IT-TOF-MS)，自动进样器，柱温箱，UV检测器(日本岛津公司)；LC-MS solution工作站；5424R小型台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf)； XS205型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；Inertsil ODS-SP C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(日本岛津公司)；KQ3200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；RE-52 A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；循环水真空泵(上海知信实验仪器技术有限公司)；移液器(德国Eppendorf公司)。

1.2 药材

实验所用药材法半夏、炙甘草、黄芩、干姜、黄连和大枣购于首都医科大学附属北京友谊医院中药剂科，人参购于盛实百草药业有限公司，生(鲜)姜购于北京人卫中药饮片厂。经首都医科大学附属北京友谊医院赵奎君教授鉴定，法半夏为天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.) Breit.的干燥块茎的炮制加工品；炙甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根茎的炮制品；黄芩为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根炮制品；生姜为姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的新鲜根茎炮制品；干姜为姜科植物姜ZingiberofficinaleRosc.的干燥根茎炮制品；黄连为毛茛科植物云连CoptisteetaWall.的干燥根茎炮制品；人参为五加科植物人参PanaxginsengC. A. Mey的干燥根和根茎炮制品；大枣为鼠李科植物枣ZiziphusjujubaMill.的干燥成熟果实。各药材具体来源和批号见表1。

表1 8味药材的产地和批号Tab 1 Origin areas and batch numbers of 8 kinds of traditional Chinese medicine

1.3 药品与试剂

对照品：绿原酸(批号为140730，含量≥98%，成都克洛玛生物科技有限公司)；甘草苷(批号为111610-201607，含量以93.1%计，中国食品药品检定研究院)；姜黄素(批号为0823-9802，中国食品药品检定研究院)；6-姜辣素(批号为111833-201806，含量≥99.9%，中国食品药品检定研究院)；黄芩素(批号为491-67-8，含量≥98%，中国药品生物制品检验所)；汉黄芩素(批号为153-18-4，含量≥98%，中国药品生物制品检验所)；黄芩苷(批号为110715-201016，含量以94.0%计，中国药品生物制品检验所)；盐酸小檗碱(批号为110713-201814，含量≥86.7%，中国食品药品检定研究院)；黄连碱(批号为B20560，含量≥98%，上海源叶生物科技有限公司)。水为屈臣氏蒸馏水；甲醇、甲酸为色谱纯(Fisher Scientific公司)。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱为Inertsil ODS-SP C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸甲醇溶液(B)，按照表2进行梯度洗脱。流速为0.8 ml/min，检测波长为254 nm，柱温为40 ℃，进样量为10 μl。

表2 梯度洗脱程序Tab 2 Gradient elution procedures

2.2 供试品溶液的制备

参照《伤寒论》第157条生姜泻心汤药味组成及配比，经过改进后制备生姜泻心汤水提液。准确称取生姜12 g，人参9 g，黄芩9 g，炙甘草9 g，法半夏9 g，干姜3 g，黄连3 g，大枣9 g，置于圆底烧瓶中，加8倍量水充分浸润，放置浸泡用3层纱布过滤，滤渣加6倍量水微沸回流提取20 min，过滤，合并2次的滤液，浓缩至50 ml，得生药质量浓度为1.26 g/ml，4 ℃冷藏备用。取生姜泻心汤药液，加适量超纯水稀释至0.1 g/ml，涡旋1 min，4 ℃下以12 000 r/min离心10 min，取上清液，以0.22 μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液。参考文献，将处方中的8种药材按不同产地和批号进行排列组合，投药制备得到10批生姜泻心汤[16-17]。排列组合结果见表3；具体药材来源组成见表1。10批生姜泻心汤(S1—S10)分别按照上述方法制备供试品溶液。

表3 10批生姜泻心汤药材来源批号随机分组表Tab 3 Random source table of 10 batches of Shengjiang Xiexin decoction

2.3 对照品溶液的制备

取各对照品适量，精密称定，加甲醇配制成对照品溶液(绿原酸100 μg/ml，甘草苷70 μg/ml，黄连碱100 μg/ml，盐酸小檗碱25 μg/ml，黄芩苷200 μg/ml，黄芩素25 μg/ml，汉黄芩素90 μg/ml，6-姜辣素30 μg/ml，姜黄素30 μg/ml)，以0.22 μm微孔滤膜过滤，4 ℃冷藏备用。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验：取同一供试品溶液(S1)，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录图谱。

2.4.2 重复性试验：按“2.2”项下供试品溶液制备方法，平行制备S1生姜泻心汤供试品溶液6份(S1-1—S1-6)，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录图谱。

2.4.3 稳定性试验：将供试品溶液S1分别在0、2、4、8、12和24 h按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。

2.5 指纹图谱的建立及相似度评价

将混合对照品溶液按照“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录色谱图。取10批生姜泻心汤(S1—S10)按照“2.1”项下的方法进行测定，记录色谱图。按照《中药色谱指纹图谱》要求，将10批生姜泻心汤供试品溶液的图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)”进行分析，对峰面积较大、分离度较好的色谱峰进行标定。

3 结果

3.1 方法学考察结果

3.1.1 参照峰的选择：在生姜泻心汤的指纹图谱中，选择峰面积较大而且稳定、分离度较好的5个峰(1号、6号、18号、27号和31号峰)作为指纹图谱方法学考察的参照峰，且上述峰分布在指纹图谱的整个时间段内。在以下的方法学考察研究中，均以各供试品溶液色谱图中的1号、6号、18号、27号和31号色谱峰为参照峰，计算其保留时间的RSD和峰面积的RSD。

3.1.2 精密度考察结果：记录6次进样的色谱图，将数据导入指纹图谱相似度评价软件进行处理，进行色谱峰匹配，6次进样的图谱与对照图谱相似度均>0.998。计算各参照峰保留时间的RSD，结果均<0.38%；计算其峰面积的RSD，结果均<2.95%；表明该方法精密度良好，符合特征图谱相关要求。精密度考察结果见表4—5。

表4 精密度考察结果(保留时间)(n=6)Tab 4 Precision test results(retention time)(n=6)

3.1.3 重复性考察结果：记录6次进样的色谱图，将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)”进行处理，进行色谱峰匹配，6次进样图谱与对照图谱相似度均>0.995。计算各参照峰保留时间的RSD，结果均<1.30%；计算其峰面积的RSD，结果均<4.81%；表明该方法的重复性好，符合特征图谱相关要求。重复性考察结果见表6—7。

表5 精密度考察结果(峰面积)(n=6)Tab 5 Precision test results(peak area) (n=6)

表6 重复性考察结果(保留时间)(n=6)Tab 6 Repeatability test results (retention time) (n=6)

表7 重复性考察结果(峰面积)(n=6)Tab 7 Repeatability test results (peak area) (n=6)

3.1.4 稳定性考察结果：记录6次进样的色谱图，将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2 004 A版)”进行处理，进行色谱峰匹配，6次进样图谱与对照图谱相似度均>0.997。计算各参照峰保留时间的RSD，结果均<0.55%；计算其峰面积的RSD，结果均<4.37%；表明供试品溶液在24 h内稳定，符合特征图谱相关要求。稳定性考察结果见表8—9。

表8 稳定性考察结果(保留时间)(n=6)Tab 8 Stability test results (retention time) (n=6)

表9 稳定性考察结果(峰面积)(n=6)Tab 9 Stability test results (peak area) (n=6)

3.2 指纹图谱的构建

将10批药材的供试品溶液在上述色谱条件下进行分析，导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A版)”进行处理，以S1为参照谱，采用平均数法，时间窗宽度设定为0.1，多点校正，色谱峰自动匹配，生成对照指纹图谱，并计算相似度。混合对照品HPLC图见图1。生姜泻心汤HPLC指纹图谱见图2(编号S1—S10为10批样本的液相色谱，R为对照指纹图谱)，共标定出41个共有峰。

图2 10批生姜泻心汤指纹图谱Fig 2 HPLC fingerprint of 10 batches of Shengjiang Xiexin decoction

3.3 指纹图谱相似度评价

指纹图谱相似度越接近1，说明色谱图间相似度值越高。10批生姜泻心汤指纹图谱相似度见表10。由表10可见，10批样品的相似度都>0.99，表明不同批次生姜泻心汤之间相似度良好，质量稳定，说明用于后期药效实验的生姜泻心汤品具有较好的稳定性，同时该指纹图谱可为生姜泻心汤药理药效实验的重复性提供参考。

表10 10批生姜泻心汤指纹图谱相似度Tab 1 0 Similarity of chromatographic fingerprint of 10 batches of Shengjiang Xiexin decoction

4 讨论

本研究中，生姜泻心汤供试品制备方法参考传统煎煮方法。同时，前期考察了不同流动相梯度洗脱系统(乙腈-水、甲醇-水和0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸溶液)、不同柱温(20、25、30和40 ℃)和不同流动相流速(0.6、0.8和1 ml/min)。结果发现，流动相为0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水，柱温为40 ℃，流动相流速为0.8 ml/min的分离效果最好，故选择上述条件进行分析。

10.绿原酸；17.甘草苷；20.黄连碱；24.盐酸小檗碱；27.黄芩苷；33.黄芩素；34.6-姜辣素；38.汉黄芩素；39.姜黄素10. chlorogenic acid; 17. glycyrrhizin; 20. baicalin; 24. berberine hydrochloride; 27. baicalin；33. baicalein; 34. 6-curcumin; 38. wogonin; 39. curcumin图1 混合对照品HPLC图Fig 1 HPLC of mixed reference

本研究应用HPLC法成功建立了生姜泻心汤指纹图谱，标定了41个共有峰，并通过对照品对比确认了绿原酸、甘草苷、黄连碱、盐酸小檗碱、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、6-姜辣素和姜黄素9个共有峰；查阅文献可知，绿原酸来自于大枣[18]，甘草苷来自于甘草，黄连碱、盐酸小檗碱来源于黄连[19-20]，黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素来源于黄芩[21]，6-姜辣素、姜黄素来源于生姜和干姜[22]。另外，生姜泻心汤中人参为贵重药材，其成分的指认非常重要，但是本研究中人参主要成分为末端吸收、紫外吸收低且干扰大[23-24]，故暂未进行分析。本研究也未发现半夏的指标性成分，尚不能体现其专属性成分。在后续研究中将进一步采用质谱检测器并重点对亲水性成分进行研究，建立更加全面的生姜泻心汤液相指纹图谱分析方法。

本研究进行了精密度、重复性和稳定性等方法学考察，结果表明，所用色谱方法符合指纹图谱技术定性研究要求；10批生姜泻心汤相似度>0.95，表明不同批次的生姜泻心汤之间相似度良好，质量稳定。表明该方法可以为生姜泻心汤的质量控制提供参考，保证后期药效学实验所用的生姜泻心汤质量稳定，为实验的重复性作参考，且对生姜泻心汤的临床应用有重要意义。