基于网络药理学研究二仙汤治疗乳腺癌的作用机制Δ

房立源，李慧杰，王志鹏，李秀荣#

(1.山东中医药大学第一临床学院，山东 济南 250014； 2.山东中医药大学附属医院肿瘤科，山东 济南 250014)

国家癌症中心最新发布的统计数据表明，乳腺癌发病率为17.10%，在女性肿瘤中居首位，患者数约为30.4万例，且具有发病率逐年升高和年轻化的趋势[1-2]。乳腺癌属于中医“乳岩”“乳核”和“石奶”等疾病范畴，乳腺癌中医辨证分型有冲任失调、肝郁气滞、正虚毒炽、肝肾阴虚和气阴两虚5种证型，其中冲任失调证是临床上最常见的中医证型，治疗方剂常选用二仙汤。二仙汤由仙灵脾、仙茅、知母、巴戟天、当归和黄柏6味中药组成，方中仙茅、仙灵脾和巴戟天温补肾阳、益肾生精，知母、黄柏滋阴泄火，当归滋阴养血、调理冲任。近年来，中医药成为乳腺癌全周期治疗过程中的重要组成部分。中医药治疗乳腺癌的效果显著，尤其是在减毒增效、预防复发转移[3-4]、防治肿瘤及治疗相关并发症[5-6]和提高患者生活质量[7-8]等方面得到了越来越多的认可和支持。随着科学技术的发展，网络药理学-分子对接技术逐渐成为新型的疾病-药物预测模型。本研究运用网络药理学方法收集二仙汤的活性成分和靶点，分析预测其作用于乳腺癌的潜在机制，验证活性成分和核心靶点的结合强度，为二仙汤在临床上的广泛使用提供更多有价值的参考。

1 资料与方法

1.1 二仙汤活性成分的收集和筛选

在中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)数据库和UniProt数据库(https://www.uniprot.org/uniprot/)中获取二仙汤药物活性成分和相关作用靶点。其筛选条件为口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，类药性(drug-likeness，DL)≥0.18。

1.2 乳腺癌作用靶点的获取

在GeneCards(https: //www. genecards.org /)、OMIM (https: //www. omim.org /)和CTD(https：//ctdbase. org/)数据库中搜索主题词为“Breast Cancer”，检索并筛选乳腺癌相关的作用基因。去除重复项后，利用Venny 2.1在线工具进行二仙汤作用靶点和乳腺癌靶点的映射并绘制韦恩图。

1.3 药物-成分-靶点-疾病网络图

将二仙汤活性成分和作用靶点导入Cytoscape Version 3.7.1软件，绘制“二仙汤活性成分-作用靶点-乳腺癌”网络图。网络图的节点表示作用靶点、活性成分、乳腺癌或药物组成，边表示两者之间具有相互作用。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein Interaction，PPI)网络构建

将二仙汤作用靶点和乳腺癌疾病靶点交集部分输入到STRING数据库中(https://string-db.org/)，选择物种为“Homo sapiens”，设定相互作用阀值为“medium confidence=0.4”，并隐藏游离节点，获得PPI网络图。

1.5 关键靶点和蛋白模块分析

运用Cytoscape Version 3.7.1软件对“1.4”项下获得的网络图进行拓扑属性分析，计算网络图整体的中介中心性(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)和点度中心性(degree Centrality，DC)，以BC、CC和DC的平均数为阈值，选取BC、 CC和DC同时在阈值之上的靶点为关键靶点，最后运用Cytoscape Version 3.7.1软件的MCODE插件筛选PPI网络中的重要蛋白模块。

1.6 富集分析

通过R语言把二仙汤-乳腺癌的共有靶点转化成entrezlD，加载“BiocManager”和“clusterProfiler”等程序包，运行R语言获得基因本体(gene ontology, GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析的气泡图。最后运用Perl语言把entrezlD 转换为基因靶点信息。根据生物过程分析和通路富集结果，对二仙汤治疗乳腺癌的物质基础和分子机制进行分析预测。

1.7 活性成分与关键靶点的分子对接

选取二仙汤的主要活性成分与核心靶点蛋白进行分子对接。从PDB数据库中下载靶点蛋白的3D结构，从TCMSP数据库中下载化合物结构，并保存为mol2格式。利用PYMOL软件对靶点蛋白进行去水除配体，运行AutoDock 1.5.6软件将活性成分及靶点蛋白进行加氢、加电荷，再运行Auto dock vina软件进行分子对接验证，使用PYMOL软件把对接结果进行图片展示[9]。相关文献报道，化合物和靶标之间结合自由能<-5 kcal/mol被认为具有较好作用[10]。

2 结果

2.1 二仙汤的活性成分和作用靶点

在TCMSP中根据检索条件检索仙茅、仙灵脾、巴戟天、知母、黄柏和当归的有效成分，去除重复项后，共筛选出符合条件的活性成分93个，作用靶点154个。运用Cytoscape Version 3.7.1软件对活性成分进一步分析，度值(Degree)排序居前10位的活性成分见表1。

表1 二仙汤活性成分(度值排序居前10位)Tab 1 Active components of Erxian decoction(top 10，ranked by Degree value)

2.2 乳腺癌的作用靶点

以“Breast Cancer”为关键词在Gene Cards、OMIM和CTD数据库进行检索，合并3个数据库检索内容，删除重复项，最终寻找到疾病相关靶点基因364个，并将二仙汤作用靶点和乳腺癌疾病靶点进行映射并绘制韦恩图，见图1。

图1 Venny图Fig 1 Venny diagram

2.3 药物-疾病-靶点网络图

运用Cytoscape Version 3.7.1软件绘制“二仙汤-成分-靶点-乳腺癌”网络图，二仙汤的64个药效成分通过调控40个靶点治疗乳腺癌。从网络图中可以看出，二仙汤活性成分和靶点存在一对多的关系，见图2。

图2 “药物-成分-靶点-疾病”网络图Fig 2 Network diagram of “drug-component-target-disease”

2.4 PPI网络图

将二仙汤作用靶点与乳腺癌作用靶点的交集基因(40个)导入STRING数据库，构建蛋白质互相作用PPI网络图，见图3。

图3 PPI网络图Fig 3 PPI network

2.5 关键靶点和蛋白模块分析

通过Cytoscape Version 3.7.1计算得到，PPI网络中度值平均数为18.25，间距中心度平均数为0.014，紧密中心度平均数为0.665，将节点的度值、紧密中心度和间距中心度均>其平均数的节点基因作为核心靶基因，共获得核心靶点基因12个，运用Cytoscape Version 3.7.1软件的MCODE插件筛选PPI网络中的蛋白模块，以度值=2，节点得分=0.2，k-core=2，最大深度=100作为筛选参数，筛选得到3个重要蛋白模块，见图4—5。

图4 核心靶点网络图Fig 4 Network diagram of core target

图5 重要蛋白模块Fig 5 Modules of important protein

2.6 富集分析

2.6.1 GO功能富集分析：对40个潜在作用靶点进行生物功能富集分析，共有1 502条GO数据条目(P<0.05)。生物学过程(biological process，BP)条目数最多，共有1 401个，根据通路上富集到靶点数目多少来看，主要集中在细胞对化学应激的反应(cellular response to chemical stress)、对氧化应激的反应(response to oxidative stress)和对活性氧的反应(response to reactive oxygen specise)；分子功能(molecular function，MF)相关条目有75个，主要涉及到血红素结合(heme binding)、四吡咯结合(tetrapyrrole binding)和氧化还原酶活性(oxidoreductase activity)；细胞组成(cell component，CC)相关条目有26个，主要有细胞膜筏(membrane raft)和细胞膜微区(membrane microdomain)，见图6—8。

图6 生物学过程GO功能富集分析Fig 6 GO function enrichment analysis of biological process

图7 分子功能GO功能富集分析Fig 7 GO function enrichment analysis of molecular function

图8 细胞组成GO功能富集分析Fig 8 GO function enrichment analysis of cell component

2.6.2 KEGG通路富集分析：对40个交集靶点进行KEGG分析，共得到101条代谢通路(P<0.05)。二仙汤治疗乳腺癌主要涉及流体剪切应力和动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)和PI3K-Akt信号通路(PI3K-AKT signaling pathway)，见图9。

图9 KEGG通路富集分析Fig 9 KEGG pathway enrichment analysis

2.7 分子对接

分子对接结果显示，二仙汤主要活性成分quercetin、kaempferol、Isocorypalmine和beta-sitosterol与TP53、IL-6和JUN均具有较好的结合力，其中TP-53与活性成分的结合较为紧密，见图10—11。

图10 分子对接结果Fig 10 Results of molecular docking

3 讨论

清代名医陈实功在其著作《外科正宗》[11]中描述为“乳岩乃忧郁伤肝，思虑伤脾，积想在心……其时五脏俱衰，四大不救，名曰乳岩”。由此可见，乳岩的发生大多是忧郁思虑等情志所伤，脏腑功能失调，湿聚痰凝，气滞血瘀，炼液成核，发为肿块。著名中医妇科学家夏桂成教授认为，乳腺癌的发生与肾密切相关，主张肾气亏虚是其主要的病因[12]。乳腺癌的病位虽在乳房，但是与肝、脾和肾等脏腑关系紧密，病机主要涉及肝脾不调、痰湿瘀毒、冲任失调和气血亏虚等方面，在治疗上多采用扶正祛邪、调和肝脾、解毒散结和调理冲任等治疗原则。

本研究运用网络药理学-分子对接技术，探讨二仙汤治疗乳腺癌的可能作用机制。在二仙汤活性成分中，槲皮素、山柰酚、异延胡索单酚碱和β-谷甾醇为核心化合物。有研究结果发现，槲皮素可抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖，阻断恶性肿瘤细胞迁移、运动和侵袭，且随着槲皮素浓度升高，抗肿瘤作用增强[13]。槲皮素可逆转乳腺癌非甾体类抗雌激素治疗药物他莫昔芬的耐药性[14]。李鹰飞等[15]的实验研究结果证明，山柰酚在体外条件下可抑制乳腺癌SK-BR-3细胞增殖，并促进其凋亡。赵明智等[16]的研究结果发现，山柰酚可通过抑制PI3K/AKT/GSK-3β信号通路，进而促进人炎性乳腺癌SUM190细胞株凋亡。闫倩等[17]的研究结果发现，异延胡索单酚碱具有较好的抗肿瘤作用。孙玉成等[18]通过体外实验证实，β-谷甾醇可通过PI3K/AKT/m TOR信号通路诱导细胞自噬，促进胃癌细胞凋亡。陶仕英等[19]通过体外实验证明，高浓度β-谷甾醇可直接将ER阳性人乳腺癌T47D细胞阻滞在G0/G1期，从而抑制恶性肿瘤细胞增殖。

图11 TP-53与活性成分的分子对接Fig 11 Molecular docking of TP-53 with active components

在靶点网络图中，TP-53、IL-6和JUN处于核心地位。TP-53是一种抑癌基因，通过调节细胞周期、修复和凋亡等发挥抗恶性肿瘤作用[20]；当其发生基因突变时，其在恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移等方面发挥重要作用[21]。研究结果发现，在TP-53基因突变的女性人群中，60岁时乳腺癌累计发病率接近85%，多见于三阴性乳腺癌和Her-2阳性的乳腺癌患者[22-23]。高IL-6水平与乳腺癌患者淋巴转移和远处转移密切相关，因此，IL-6水平可作为早期诊断、病情研判和预后评价的潜在生物学标志物[24]；并且，激活的IL-6信号通路能增强Her-2阳性乳腺癌对曲妥珠单抗的耐药性，降低治疗效果[25]。JUN(转录因子AP-1)与高侵袭性乳腺癌相关，现有研究结果证实，JUN及其受体有希望成为新的免疫治疗靶点[26-27]。分子对接结果表明，核心化合物与靶点间均具有很好的结合力，其中槲皮素、山柰酚、异延胡索单酚碱和β-谷甾醇与TP-53的结合力最强，进一步提示TP-53很有可能成为二仙汤治疗乳腺癌的重要靶点。

进一步的富集分析结果显示，二仙汤治疗乳腺癌涉及多个生物学过程，主要集中在细胞对应激的反应和氧化还原酶活性等；代谢通路富集通路分析结果显示，关键靶点主要富集在流体剪切应力和动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、PI3K-AKT和MAPK信号通路，乳腺癌、内分泌抵抗和癌症中的蛋白多糖等代谢途径。这些代谢通路均与乳腺癌的形成和发展密切相关。流体剪切应力和动脉粥样硬化通路可调节肿瘤血管的再生，促进肿瘤细胞增殖[28]。PI3K-AKT信号通路在乳腺癌细胞分化和转移方面也起到重要作用[29]。

综上所述，本研究运用网络药理学方法对二仙汤中化学成分、作用靶点进行了探讨，从中可以得出二仙汤治疗乳腺癌具有多成分、多靶点和多通路等特点。二仙汤的主要化合物槲皮素、山柰酚、异延胡索单酚碱和β-谷甾醇，可能以TP-53、IL-6和JUN为主要作用靶点，通过调节细胞周期、参与血管再生和PI3K-AKT/MAPK信号通路等生物学过程发挥作用。