天蚕素抗菌肽的生物信息学分析

杨红艳，卢 奎,2*，杜 蘅，刘广斌

1.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001 2.郑州工程技术学院 化工食品学院，河南 郑州 450044 3.郑州大学 化学与分子工程学院，河南 郑州 450001

近年来，随着食品工业的快速发展，微生物污染引起的食品安全问题和耐药菌导致的环境安全问题逐渐成为备受关注的焦点。食品在加工、贮藏、运输及消费过程中，微生物污染是引起食品腐败变质的主要原因之一[1]。在世界范围内，每年由于微生物污染引发的食品安全事件频频发生，造成难以估计的损失。因此，食品防腐剂的使用在食品安全中扮演着重要角色，目前常见的食品防腐剂有山梨酸、苯甲酸及其盐类等化学防腐剂[2]，虽然化学防腐剂的防腐效果稳定且价格低廉，但近年来由于其大规模使用甚至滥用，消费者对其安全性日益担忧。有研究发现长期过量食用化学防腐剂会对人体造成积累性慢性伤害，甚至带来致畸、致癌等危害[3-4]。因此，寻找新型安全高效的食品防腐剂已成为食品工业的研究热点之一。

抗菌肽(antimicrobial peptides)，又称抗微生物肽或宿主防御肽，是自然界生物体内广泛存在的一类分子多肽，是生物先天免疫的重要防御物质，普遍具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、抗寄生虫及免疫调节等生物活性[5-6]。由于其安全、高效、抑菌谱广、热稳定性好、杀菌速度快、无免疫原性、作用机理独特等优点，预示着抗菌肽在食品安全领域有着巨大应用潜力[7]。抗菌肽来源广泛，包括细菌、真菌、昆虫、植物和两栖类动物等[8-9]。昆虫作为世界上种类最为繁多的生物物种之一，其生活环境复杂，遍布于除深海和极地外的每一个角落，具备较完善的自我防御系统，自身能够分泌抗菌物质来实现自我保护[10]。迄今为止，在昆虫中发现的抗菌肽达200余种，占已知抗菌肽总数的10%左右。天蚕素抗菌肽是最早被发现的一类抗菌肽，主要是由昆虫等分泌产生的具有抑菌性能的小分子肽类物质，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤和抗寄生虫等生物活性[11-12]。自1972年瑞典科学家Boman等[13]首先从惜古比天蚕血淋巴中分离得到天蚕素抗菌肽以来，科学家相继发现多种天蚕素抗菌肽，其结构特征和基因序列也先后得到确定[14-15]。

生物信息学是以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学，目前已广泛应用于生物科学、临床医药、工农业等领域[16]。近年来诸多学者尝试将生物信息学应用于抗菌肽的筛选和预测，并取得一定的成果。刘悦等[17]利用生物信息学工具对东北林蛙抗菌肽dybowskin-1ST的理化参数、亲/疏水性、剪切位点、信号肽、跨膜区域、结构等进行预测及分析，进而通过小鼠伤口愈合试验及体外抑菌试验进行活性验证。Taniguchi等[18]利用生物信息学方法从低蛋白大米副产品中鉴定出阳离子抗菌肽，并通过试验验证其抗菌活性。Wang等[19]借助生物信息学工具对天蚕素抗菌肽Cecropin-A进行改造，获得抗菌活性更高的抗菌肽PEW300，并对其抗菌机制进行研究。作者基于抗菌肽数据库，利用生物信息学方法，对9种天蚕素抗菌肽的理化性质、氨基酸组成、疏水性、跨膜区域、信号肽、亚细胞定位、二级结构、磷酸化和糖基化位点等进行预测分析，以期为深入研究天蚕素抗菌肽的构效关系、抗菌活性和作用机制提供理论基础，同时为新型抗菌肽的设计改造提供思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取抗菌肽数据库DRAMP(http://dramp.cpu-bioinfor.org/)中的9种天蚕素抗菌肽(Cecropin)进行生物信息学分析，其来源及氨基酸序列如表1所示。

表1 天蚕素抗菌肽的来源及氨基酸序列Table 1 Sources and amino acid sequences of cecropin antimicrobial peptides

1.2 生物信息学分析方法

所用的生物信息学分析工具如表2所示。

表2 抗菌肽生物信息学分析工具Table 2 Bioinformatics analysis tools for the analysis of antimicrobial peptides

2 结果与分析

2.1 天蚕素抗菌肽的理化性质分析

利用SIB维护的专业蛋白质分析系统下的蛋白质分析工具ProtParam tool对天蚕素抗菌肽的理化性质进行预测分析，结果见表3。

从表3可看出，9种天蚕素抗菌肽由31～37个氨基酸残基组成，分子质量较小，大约为3 500 Da，免疫原性较低。9种天蚕素抗菌肽均为阳离子型多肽，理论等电点(pI)在9.52～11.17之间，pH为7时带2～7个正电荷，说明多肽在中性条件下溶解性较好，不易出现凝集和沉淀析出的现象，有利于抗菌肽的分离纯化和应用。Cecropin-B、Cecropin XJ、Cecropin-P4的不稳定指数大于40，推测为不稳定多肽，其余多肽的不稳定指数小于40，推测为稳定性多肽。9种抗菌肽的脂肪族指数均较高，在85.16～114.29之间，推测其热稳定性较好。总平均亲水性值(GRAVY)可用来预测多肽的亲水性强弱，范围在-2～+2之间，正值越大表示疏水性越强，负值越大表示亲水性越好。除Cecropin-C外，其余抗菌肽的GRAVY为负值，表明该抗菌肽呈亲水性，这一特性有利于其在以水为溶剂的食品体系中发挥抗菌活性[20]。

表3 天蚕素抗菌肽的理化性质分析Table 3 Physicochemical properties of cecropin antimicrobial peptides

抗菌肽的抗菌活性往往与其理化特性有关，比如氨基酸组成、肽链长度、电荷数目与分布、空间结构、疏水性和两亲性等[21-23]。一般认为，阳离子型抗菌肽具有较好的抗菌活性，抗菌肽首先通过静电作用吸附聚集在细菌表面，之后通过桶板模型、覆毯模型或者环孔模型等方式发挥抗菌作用[24]。本文中研究的9种天蚕素抗菌肽中含有多个精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸，使整个分子带正电荷，这是天蚕素抗菌肽发挥抗菌活性的重要基础之一。

稳定性是抗菌肽应用的重要前提条件之一，经预测，9种天蚕素抗菌肽的热稳定性较好。伍小松等[25]研究表明天蚕素抗菌肽在100 ℃加热5～15 min仍具有较好的抗菌活性。Kim等[26]从燕尾蝶中分离得到的类天蚕素抗菌肽Papiliocin在100 ℃下加热10～15 min仍可保持一定的活性，且对较高离子强度和酸碱具有一定的抗性。以上试验结果和本文中预测的热稳定性结果基本相符，预示着天蚕素抗菌肽在食品防腐保鲜方面具有较大的应用空间。

2.2 天蚕素抗菌肽的氨基酸组成分析

利用Pepstats工具分析了天蚕素抗菌肽的氨基酸残基组成，分析结果见图1。

极微氨基酸Tiny：(A+C+G+S+T);小侧链氨基酸Small：(A+B+C+D+G+N+P+S+T+V);脂肪族氨基酸Aliphatic：(A+I+L+V);芳香族氨基酸Aromatic：(F+H+W+Y);非极性氨基酸Non-polar：(A+C+F+G+I+L+M+P+V+W+Y);极性氨基酸Polar：(D+E+H+K+N+Q+R+S+T+Z);带电荷氨基酸Charged：(B+D+E+H+K+R+Z);碱性氨基酸Basic：(H+K+R);酸性氨基酸Acidic：(B+D+E+Z)图1 天蚕素抗菌肽的氨基酸组成分析Fig.1 Composition analysis of amino acids of cecropin antimicrobial peptides

从图1可看出，9种天蚕素抗菌肽中非极性氨基酸残基物质的量占比最高，在45%～68%之间；极性氨基酸残基的物质的量占比在31%～55%之间，其中碱性氨基酸残基(24%)约是酸性氨基酸残基(9.7%)的3倍。以细菌细胞膜为靶标的抗菌肽，其疏水性须保持在一定范围内，通常疏水残基占50%，疏水性过高则会导致抗菌肽聚集进而形成沉淀，使得抗菌活性降低，同时溶血活性增强；疏水性过低则会造成抗菌肽对细菌细胞膜的插入能力减弱，导致抗菌活性降低[27]。9种天蚕素抗菌肽的疏水性残基占45%～68%，推测天蚕素抗菌肽有较高的抗菌活性和较低的溶血活性。

有研究表明，抗菌肽的净电荷数与抗菌活性之间存在一定相关性，带正电荷的多肽与带负电荷的磷脂之间的静电作用是抗菌肽破坏细菌的第一步，并且这种静电作用可增强抗菌肽的选择性[28]。9种抗菌肽的碱性氨基酸残基物质的量占比均大于酸性氨基酸，使抗菌肽带正电荷，有利于天蚕素抗菌肽与带负电荷的细菌细胞膜通过静电作用结合在一起。

2.3 天蚕素抗菌肽的疏水性/亲水性分析

利用ProtScale工具对天蚕素抗菌肽的亲水性/疏水性进一步分析，滑窗大小为9，用线性加权模型。结果如图2所示。

图2 天蚕素抗菌肽的疏水性/亲水性分析Fig.2 Hydrophobicity and hydrophilicity analysis of cecropin antimicrobial peptides

从图2可看出，9种抗菌肽的N-端均在负值区域，为亲水区，C-端均在正值区域，为疏水区。Gregory等[29]报道抗菌肽Cecropin-A的N-端含多个碱性氨基酸，具有亲水性，中间存在一个铰链区，C-端为疏水区，与本文中预测结果基本一致，说明ProtScale工具对抗菌肽的疏水性预测具有较高的准确性。

2.4 天蚕素抗菌肽的两亲性和疏水力矩分析

抗菌肽的两亲性结构在多肽与细菌相互作用过程中发挥重要作用，几乎所有的抗菌肽与细胞膜作用时都会形成两亲性结构，进而增强其破膜能力[30]。两亲性使得氨基酸在螺旋的侧面上形成疏水力矩，因此多肽的疏水力矩可用来反映其两亲性[31]。利用HeliQuest软件预测天蚕素抗菌肽的疏水力矩(μH)，结果如表4所示。

从表4可看出，Cecropin-P4的疏水力矩最小，为0.157，Cecropin-C的疏水力矩最大，为0.334，其余7种肽的疏水力矩在0.25左右，因此推测Cecropin-C的破膜能力最强。

表4 天蚕素抗菌肽的疏水力矩Table 4 Hydrophobic moment (μH) of cecropin antimicrobial peptides

螺旋轮是研究多肽α-螺旋结构的有效工具，可直观地反映多肽极性面和非极性面的氨基酸分布，有利于更好地分析多肽的两亲性[32]。利用NetWheels工具绘制了天蚕素抗菌肽的螺旋轮图，如图3所示。从图3可看出，天蚕素抗菌肽的疏水性氨基酸和亲水性氨基酸分别相对集中地分布在疏水区和亲水区，使整个分子呈现两亲性α-螺旋的结构。Nielsen等[33]研究表明天蚕素抗菌肽具有两亲性α-螺旋结构，通过膜损机制实现抗菌目的，和本文中预测结果基本相符。

2.5 天蚕素抗菌肽的二级结构预测

二级结构在抗菌肽发挥抗菌作用过程中起重要作用。Lv等[34]对猪源抗菌肽PMAP-36的结构、抗菌活性及作用机理进行了研究，结果表明PMAP-3的α-螺旋区为与细菌细胞膜相互作用的区域。利用HNN预测工具对天蚕素抗菌肽的二级结构进行预测，表5为抗菌肽二级结构中各成分的含量，图4为抗菌肽的二级结构分布图。

表5 天蚕素抗菌肽的二级结构的组成Table 5 Predicted secondary structures of cecropin antimicrobial peptides %

注：h代表α-螺旋；c代表无规卷曲；e代表延伸链。图4 天蚕素抗菌肽的二级结构分布图Fig.4 Secondary structure distribution diagrams of cecropin antimicrobial peptides

从表5可看出，9种天蚕素抗菌肽的二级结构均以α-螺旋结构为主，含量在42.86%～67.74%之间，无规卷曲含量在22.22%～40.00%之间。Cecropin-C、Cecropin-D无延伸链，其他抗菌肽延伸链含量较低。推测天蚕素抗菌肽的二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主。从图4可看出，Cecropin-A、Cecropin-B、Cecropin-P1、Cecropin-P2、Cecropin-P3的α-螺旋结构主要位于N-端；Cecropin-C、Cecropin-D、CecropinXJ、Cecropin-P4的N-端和C-端均含有α-螺旋结构，且中间位置存在α-螺旋的中断者，构成螺旋-卷曲-螺旋结构。Boman等[15]采用圆二色和二维核磁共振对天蚕素抗菌肽的二级结构进行测定，结果表明天蚕素抗菌肽分子结构中含有2个α-螺旋，中间由丙氨酸-甘氨酸-脯氨酸(Ala-Gly-Pro)组成的铰链区连接，形成螺旋-卷曲-螺旋结构。Giacometti等[35]同样报道了天蚕素抗菌肽具有螺旋-卷曲-螺旋结构，并通过试验表明该结构对抗菌肽的稳定性或抗菌活性具有重要作用。本文中利用HNN工具预测的天蚕素抗菌肽二级结构与文献[15，35]报道的相符。

2.6 天蚕素抗菌肽的信号肽和跨膜区预测

信号肽是分泌性蛋白上的一段富含疏水性氨基酸的肽段, 用于指导蛋白质的跨膜运输。为了在各系统中表达天蚕素抗菌肽，本文中使用SignalP-5.0工具预测抗菌肽是否存在信号肽，预测结果显示9种天蚕素抗菌肽不存在信号肽，推测其属于非分泌蛋白。

跨膜区即蛋白质序列中能跨越细胞膜的区域，通常为α-螺旋结构，含有20～25个氨基酸残基，在细胞中起信号传导或转运通道等功能。通过对抗菌肽的跨膜区预测，能够对其异源表达提供指导。使用在线软件TMHMM、TMpred 预测天蚕素抗菌肽的跨膜区，预测结果表明，天蚕素抗菌肽没有跨膜区，推测其可能属于膜外蛋白，通过与细菌细胞膜相互作用而发挥杀菌作用。Peng等[36]研究表明，天蚕素抗菌肽通过与细菌细胞膜相互作用，使细胞膜的渗透性增加，导致细菌死亡，与本文中预测的抗菌机制相符。

2.7 天蚕素抗菌肽的亚细胞定位

亚细胞定位即某种蛋白或某个基因表达产物在细胞内的存在部位，有助于蛋白质功能的初步判断。利用TargetP-2.0 Service在线软件对天蚕素抗菌肽进行亚细胞定位预测，结果发现仅Cecropin-A、Cecropin-P4定位于线粒体，其他抗菌肽可能定位于细胞外。因此，推断Cecropin-A、Cecropin-P4主要在线粒体中发挥生物学作用，其他7种抗菌肽在细胞外发挥生物学作用。

2.8 天蚕素抗菌肽的糖基化和磷酸化位点

蛋白质糖基化对其功能具有重要影响，不仅影响蛋白质的空间构象、活性、运输和定位，而且在信号转导、分子识别、免疫等过程中发挥重要作用[37]。经预测，9种天蚕素抗菌肽糖基化位点的最高评分均低于0.5，推测天蚕素抗菌肽不存在糖基化位点。

蛋白质磷酸化是生物界最普遍、研究最为深入的一种蛋白翻译后修饰，在生物的整个生命活动中发挥着重要的调节作用[38]。利用NetPhos 3.1 Server对天蚕素抗菌肽的磷酸化位点进行预测，结果见表6。

从表6可看出，除Cecropin-A、Cecropin-C不存在磷酸化位点外，其他7种抗菌肽均存在磷酸化位点，且有的位点可被多种激酶磷酸化，如Cecropin-P4 第19位的丝氨酸可被unsp、PKA、cdc2激酶磷酸化，表明该抗菌肽在该位点被激酶磷酸化后，实现其生物功能。

3 结论

利用生物信息学方法对9种天蚕素抗菌肽进行预测分析，预测结果表明天蚕素抗菌肽为阳离子两亲性多肽，二级结构中α-螺旋和无规卷曲结构含量较高。推测天蚕素抗菌肽在与细菌作用过程中，抗菌肽首先通过静电作用吸附聚集在细菌表面，然后抗菌肽的疏水端通过疏水作用插入磷脂双分子层中，最终导致细胞膜通透性增加，细菌死亡。经预测，天蚕素抗菌肽具有较好的热稳定性，预示着在食品防腐保鲜方面具有较大的应用空间。天蚕素抗菌肽没有信号肽、跨膜区和糖基化位点；除Cecropin-A和Cecropin-C无磷酸化位点外，其余抗菌肽存在1～6个磷酸化位点，这对天蚕素抗菌肽的生物学功能具有重要作用。虽然利用生物信息学方法可大大降低抗菌肽的筛选或预测成本，且能得到较为满意的结果，但仍需进行后续试验来验证。本研究为深入研究天蚕素类抗菌肽的功能、构效关系及作用机制提供了理论基础，同时为新型抗菌肽的设计改造提供了思路。