针叶樱桃牡蛎多肽复合饮料工艺及抗氧化性研究

陈丽伟，杨劲松*，李 黎，吴雪帝，谭海生，仵云学

1.海南大学 食品科学与工程学院，海南 海口 570228 2.海南大学 材料科学与工程学院，海南 海口 570228 3.海南三沙大海蓝生态农业科技有限公司，海南 海口 570100

针叶樱桃原产于热带美洲，在巴西东北部大量种植[1]，被誉为“原生态维C果王”。其鲜果中VC的含量高达1 215～3 024 mg/100 g，是含量较高的天然VC来源之一[2]。与市面上的常规樱桃相比，一颗针叶樱桃的VC含量是常规樱桃的190倍。此外，针叶樱桃还有“红色珍果”“生命之果”等美称。针叶樱桃在1991年被引进海南种植[3]。大量研究报道了针叶樱桃具有显著的功能特性，钟义红等[4]的研究表明：从针叶樱桃中获得的提取物可以加强小鼠体内组织液与细胞免疫的功能。张艳杰[5]选用针叶樱桃粉作为天然VC的来源，制得的胶原蛋白肽水果复合粉具有抗氧化和延缓衰老等多种美容功能。Li等[6]的研究也表明，针叶樱桃具有很强的抗氧化能力，能够有效清除自由基，减少对人体的损伤。但是由于针叶樱桃种植难，价格昂贵，易腐烂[2]，不易保存和长途运输，其发展受到了限制，导致产品单一，市场流通困难。

牡蛎多肽是牡蛎经酶解后得到的肽链较短的多肽混合物，其分子量大都低于1 000，易于消化吸收。牡蛎多肽具有优异的抗氧化性，是一种天然的抗氧化剂[7]。汪何雅[8]的研究表明，抗氧化物质之间有协同增效作用，它们在机体内发生一系列的反应和相互作用,使得彼此的抗氧化活性显著增加。

作者以针叶樱桃和牡蛎为主要原材料，通过针叶樱桃牡蛎多肽复合饮料工艺技术，进一步优化配比，研制出高抗氧化活性的复合饮料，对提升针叶樱桃饮料品质，推动针叶樱桃行业发展和研发高抗氧化活性的复合饮料有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

针叶樱桃果：海南定安种植基地；牡蛎：市购；复合蛋白酶：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 复合饮料生产工艺

1.2.1.1 牡蛎多肽提取液的制备

挑选干净新鲜牡蛎，去掉外壳并将其冲洗干净。称取100 g新鲜牡蛎按1∶ 4(质量比)加蒸馏水打浆。打浆后的牡蛎加入600 U/g复合蛋白酶，在55 ℃恒温水浴锅中酶解4 h[9]。酶解结束后立即置于100 ℃水浴锅中灭酶15 min。灭酶后加入0.75%(质量比)活性炭，去除牡蛎的腥味[10]，之后于60 ℃水浴锅中放置25 min。结束后离心(4 000 r/min,15 min)[11]，离心后取上清液即得到牡蛎多肽提取液。

1.2.1.2 针叶樱桃汁的制备

采摘新鲜、干净、成熟、无病虫害的针叶樱桃，洗净直接打浆，在4 000 r/min、20 min条件下离心，取上清液得到针叶樱桃汁。

1.2.1.3 调配

按照响应面优化后的方案称取蔗糖和柠檬酸，先在烧杯中溶解，再加入牡蛎多肽提取液、针叶樱桃汁以及稳定剂，搅拌均匀定容至100 mL。

1.2.1.4 均质

将调配得到的牡蛎多肽与针叶樱桃复合饮料先加热到55 ℃，再在20～50 MPa下均质10 min。

1.2.1.5 灭菌

将调配好的牡蛎多肽与针叶樱桃复合饮料进行巴氏杀菌(90 ℃，15 min)，之后流水冷却至室温得成品。

1.2.2 单因素试验设计

基础工艺条件：卡拉胶添加量0.15%、针叶樱桃汁添加量20 g/100 mL、蔗糖添加量9%、柠檬酸添加量0.15%、牡蛎多肽提取液添加量10 g/100 mL。

选择针叶樱桃汁、蔗糖、柠檬酸、牡蛎多肽提取液为变量，在基础工艺基础上，采用单一变量进行试验。依次研究针叶樱桃汁添加量(10、15、20、25、30 g/100 mL)、蔗糖添加量(8%、9%、10%、11%、12%)、柠檬酸添加量(0.05%、 0.10%、0.15%、 0.20%、 0.25%)、牡蛎多肽提取液添加量(5、10、15、20、25 g/100 mL)等4个因素对针叶樱桃牡蛎多肽复合饮料的感官评分的影响。

1.2.3 Box-Behnken试验设计

在单因素试验的基础上，确定各因素最佳水平范围，采用响应面中心组合试验设计，选出牡蛎多肽提取液添加量(A)、针叶樱桃汁添加量(B)、蔗糖添加量(C)、柠檬酸添加量(D)为自变量，以饮料感官评分为响应值。

1.2.4 测定方法

1.2.4.1 感官评定

邀请12名专业人士从组织状态、口感、色泽、风味等4个方面进行综合评价，评价标准参考GB/T 31121—2014《食品安全国家标准果蔬汁类及其饮料》的相关内容。具体评分标准见表1。

1.2.4.2 抗氧化能力的测定

分别取牡蛎多肽提取液(8.00 g/100 mL)、针叶樱桃果汁(19.94 g/100 mL)和针叶樱桃牡蛎多肽复合饮料(牡蛎多肽质量浓度8.00 g/100 mL、针叶樱桃质量浓度19.94 g/100 mL)各2 mL于试管中，参照朱克永等[12]的方法测定DPPH清除率。每个试验均重复3次取平均值。

1.2.4.3 理化指标测定

可溶性固形物、总酸、总糖的测定:参照GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》中的方法进行测定。

铜、铅的测定：参照GB 5009.13—2017《食品安全国家标准 食品中铜的测定》和GB 5009.12—2017《食品安全国家标准 食品中铅的测定》中的方法进行测定。

1.2.4.4 微生物的测定

参照GB 4789.1—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验》规定的方法进行复合饮料微生物检测。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 牡蛎多肽提取液添加量对复合饮料感官评价的影响

由图1可知，随着牡蛎多肽提取液添加量的增大，复合饮料的综合评分呈现出先上升后下降的趋势。当多肽提取液添加量达到10 g/100 mL时，复合饮料综合评分达到最大值85分。此时复合饮料达到最佳状态，具有针叶樱桃果香和牡蛎多肽风味，色泽呈樱桃红色，状态稳定，口感最优。

2.1.2 针叶樱桃汁添加量对复合饮料感官评价的影响

由图2可知，随着针叶樱桃汁添加量的不断增大，复合饮料的感官评分先上升后下降，复合饮料的感官评分在针叶樱桃汁的添加量为20 g/100 mL时达到最大值。此时饮料具有针叶樱桃所特有的艳丽色泽，风味、口感最佳。针叶樱桃汁添加量继续增加，影响了复合饮料风味的协调性，导致综合评分下降。

2.1.3 蔗糖添加量对复合饮料感官评价的影响

从图3可以看出，综合评分随着蔗糖添加量增大呈先上升后下降趋势，当蔗糖含量为9%时，综合评分达到最大值，为86分。此时糖酸比适中，具有针叶樱桃特有的风味，色泽协调，最符合人们的口味。

图3 蔗糖添加量对复合饮料感官评价的影响Fig.3 Influence of the addition amount of sucrose on the sensory evaluation of compound beverage

2.1.4 柠檬酸添加量对复合饮料感官评价的影响

由图4可知，当柠檬酸的添加量为0.15%时，感官评分达到最大值82分。试验过程中，组织状态评分基本保持在15分，而色泽评分在14分左右有轻微波动。此时复合饮料具有浓郁的针叶樱桃的香味和牡蛎多肽的鲜味，色泽呈鲜艳的樱桃红色，特征风味显著，酸甜适宜。

图4 柠檬酸添加量对复合饮料感官评价的影响Fig.4 Influence of the addition amount of citric acid on the sensory evaluation of compound beverage

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 模型建立与数据分析

基于单因素试验分析，根据Box-Behnken中心组合设计4因子3水平的响应面分析试验，响应面试验设计及结果见表2，所得回归方程系数显著性检验结果见表3。

运用Design-Expert 8.0.6.1对表2中的试验数据进行多元回归分析，得到各因素对复合饮料感官评分作用的二次多项回归模型：

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface test design and results

Y=91.60-0.83A-1.67C+1.50D+0.25AB+3AC-5.25AD-0.50BC+0.75BD-CD-2.42A2-4.17B2-5.68C2-6.68D2。

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

从表3可以看出，C、AC、AD、A2、B2、C2、D2对复合饮品感官评分有极显著影响(P<0.01)，A、D对复合饮品感官评分有显著性影响(P<0.05)。各因素对复合饮料感官评分的影响程度为C>D>A>B。

2.2.2 影响因子交互作用分析

利用Design-Expert V8.0.6软件分析数据获得响应面图和等高线图，响应面图能够生动直观地反映出各因素及其相互作用对试验结果的影响，曲面程度越大，两因素的交互作用越显著[13-15]。由图 5 可以看出，针叶樱桃汁添加量、牡蛎多肽提取液添加量、蔗糖添加量和柠檬酸添加量之间的相互作用对感官评分的影响程度。

图5 4个因素交互作用对复合饮料感官评分影响的响应面曲线Fig.5 Response surface curve of the interaction of 4 factors on the sensory score of compound beverage

多肽提取液添加量和蔗糖添加量的交互作用对感官评分的影响极显著(P<0.01)，多肽提取液添加量和柠檬酸添加量的交互作用对感官评分影响极显著(P<0.01)，两者之间的等高线形状为椭圆形，说明两者交互作用明显。其余因素间交互作用影响不显著(P>0.05)，这与方差分析结果一致。

2.2.3 验证试验

采用Box-Behnken中心组合试验得到最佳配比：牡蛎多肽提取液添加量8.00 g/100 mL、针叶樱桃汁添加量19.94 g/100 mL、蔗糖添加量8.07%、柠檬酸添加量0.23%。选择此条件进行验证试验，制备的复合饮料感官评分为91分，与软件给出的预测值较吻合。

2.2.4 针叶樱桃牡蛎多肽复合饮料抗氧化能力测定结果

经测定，牡蛎多肽提取液(8.00 g/100 mL)DPPH清除率为75.9%，未加牡蛎多肽的针叶樱桃果汁(19.94 g/100 mL)DPPH清除率为96.4%，针叶樱桃牡蛎多肽复合饮料(牡蛎多肽提取液8.00 g/100 mL、针叶樱桃汁19.94 g/100 mL)的自由基清除率为97.6%。试验结果证明，针叶樱桃和牡蛎多肽中都含有能清除自由基的活性物质，两者复合具有增效作用，使得产品的抗氧化活性明显增强。

2.2.5 针叶樱桃牡蛎多肽复合饮料理化指标和微生物检测结果

针叶樱桃牡蛎多肽复合饮料理化指标和微生物检测结果如表4所示。

表4 复合饮料理化指标和微生物检测结果Table 4 Physicochemical indexes and microbial test results of the compound beverage

3 结论

本研究通过单因素试验以及响应面试验，确定针叶樱桃牡蛎多肽复合饮料的最佳配比为牡蛎多肽提取液添加量8.00 g/100 mL、针叶樱桃汁添加量19.94 g/100 mL、蔗糖添加量8.07%、柠檬酸添加量0.23%，以此配方调配的针叶樱桃牡蛎多肽复合饮料色泽为鲜艳的樱桃红色，针叶樱桃果香与牡蛎多肽特有风味和谐统一，酸甜可口。经过抗氧化性试验得出复合饮料的自由基清除率为97.6%，抗氧化能力明显提高。

牡蛎中的鲜味物质能够促进食欲，多种维生素和矿物质能够满足人体对铁、锌的需求，但牡蛎等海产品腥味重。针叶樱桃牡蛎多肽复合饮料通过脱腥技术可以有效地解决了这一问题，更好地满足大众需求。此外，针叶樱桃牡蛎多肽的联合抗氧化效果比单独效果更强，这也为研发高抗氧化的复合饮料提供一定的理论依据。同时，也可以带动针叶樱桃深加工产业的发展，为海南省自由贸易港海产品的进一步开发利用奠定基础。