IL-18抑制剂对脓毒症并发血小板减少小鼠的保护作用

李家富，许华，王勇强

（1.天津医科大学一中心临床学院，天津 300192；2.天津市第一中心医院重症医学科，天津市急救医学研究所，天津 300192）

血小板减少是重症监护病房（intensive care unit，ICU）危重症患者常见的并发症[1-2]，与脓毒症患者的预后密切相关[3-4]。脓毒症并发血小板减少患者的死亡率高于非血小板减少患者，且血小板减少持续2周以上者的死亡率高达66%[5]。然而目前脓毒症相关性血小板减少的分子机制尚不明确。研究显示，白细胞介素（IL）-18与脓毒症患者的死亡率呈正相关[6-7]。本课题组前期研究结果显示，IL-18与脓毒症并发血小板减少具有相关性，脓毒症患者IL-18表达水平与血小板减少程度呈负相关[8]。在此基础上，本研究采用脂多糖（LPS）单次腹腔注射法诱导脓毒症并发血小板减少小鼠模型并添加IL-18抑制剂（IL-18Bp），观察抑制IL-18对LPS诱导血小板减少小鼠模型的保护作用。IL-6、IL-10、IL-18、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是与机体发展为脓毒症密切相关的炎性标志物[9-10]，监测炎症细胞因子水平可评估IL-18Bp对脓毒症并发血小板减少小鼠的保护作用。本文旨在探讨IL-18与脓毒症并发血小板减少的关系，为脓毒症并发血小板减少的分子机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级C57BL/6雄性小鼠30只，8周龄，体重18～21g，购自中国医学科学院实验动物研究所，合格证号：SYXK（津）2019-0002，饲养于室温25℃，湿度45%~55%，每日光照8 h，自由饮水、进食1周。

1.2 主要试剂LPS（北京索莱宝科技有限公司），IL-18Bp（北京义翘神州科技股份有限公司），sCD40L检测试剂盒（上海鑫乐生物科技有限公司），IL-18、IL-6、IL-10和TNF-α ELISA检测试剂盒（深圳欣博盛生物科技有限公司）。

1.3 实验分组、模型制备与给药 将30只小鼠依次编号，按照随机数字表法分为3组：对照组、LPS模型组（LPS组）、LPS加IL-18Bp干预组（LPS/IL-18Bp组），每组10只。其中LPS组和LPS/IL-18Bp组给予单次腹腔注射30 mg/kg LPS制备脓毒症并发血小板减少模型[11]。对照组给予等体积生理盐水，LPS/IL-18Bp组在LPS注射后给予单次腹腔注射50 μg/kg IL-18Bp[12]。

1.4 观察各组72 h生存率 在LPS注射后观察各组72 h生存/死亡情况。

1.5 采集血样检测各组血小板数量 在LPS注射后24 h，每组各取5只小鼠，摘眼球取血，其中取30 μL用EDTA抗凝后全血细胞分析仪检测血小板数量，其余血样制备富血小板血浆。

1.6 ELISA检测各组富血小板血浆中sCD40L、IL-18、IL-6、IL-10和TNF-α水平 取各组富血小板血浆，按ELISA试剂盒操作步骤对各组血浆中sCD40L、IL-18、IL-6、IL-10和TNF-α的表达水平进行检测。

1.7 HE染色观察并分析各组脾脏的病理变化 收集各组造模24 h脾脏，经4%多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋，5 μm厚度切片，二甲苯及梯度酒精脱蜡水化后，苏木素染色5 min，伊红复染后封片，显微镜下200倍放大采集图像，观察脾脏组织的病理变化。

1.8 统计学处理 使用SPSS20.0软件进行数据统计分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，组间两两比较采用LSD-t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析；采用GraphPad Prism 5.0软件绘制小鼠生存曲线，采用Long-rank检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-18抑制剂对LPS诱导血小板减少小鼠生存率的影响 对照组72 h存活率为100%，LPS组24 h、48 h和72 h存活率分别为85%、64%、52%，LPS/IL-18Bp组分别为98%、95%、77%，LPS/IL-18Bp组各时间点的生存率均显著高于LPS组（χ2=0.63，P<0.05），见图1。

图1 IL-18Bp对LPS诱导TCP小鼠生存率的影响Fig 1 The effect of IL-18Bp on the survival rate of LPS-induced TCP mice

2.2 IL-18Bp对LPS诱导血小板减少小鼠外周血血小板数量的影响 在LPS注射24 h时，LPS组血小板数量显著下降，而LPS/IL-18Bp组血小板数量较LPS组高（574.23×109/Lvs.267.10×109/L），且差异具有统计学意义（t=8.37，P=0.001），见图2。

图2 IL-18Bp对LPS诱导TCP小鼠血小板数量的影响Fig 2 The effect of IL-18Bp on the platelet counts of TCP mice induced by LPS

2.3 IL-18抑制剂对LPS诱导血小板减少小鼠外周血血小板活化的影响 在LPS注射24 h时，LPS组血小板活化标志物sCD40L的表达较对照组显著升高，而LPS/IL-18Bp组血小板活化标志物sCD40L较LPS组下降（3.74 ng/mLvs.9.18 ng/mL），且差异具有统计学意义（t=8.33，P=0.001；t=4.34，P=0.012），见图3。

图3 IL-18Bp对LPS诱导TCP小鼠血小板活化标志物sCD40L表达的影响Fig 3 The effect of IL-18Bp on the expression of the platelet activation marker sCD40L of TCP mice induced by LPS

2.4 IL-18抑制剂对LPS诱导血小板减少小鼠IL-18、IL-6、IL-10和TNF-α表达的影响 与对照组相比，LPS组炎症因子IL-18、IL-6、IL-10、TNF-α表达量均升高，但抑制IL-18后，LPS对IL-18、IL-6、IL-10、TNF-α表达量的促进作用均明显下降，且组间差异具有统计学意义（与对照组相比，t=7.68、10.92、5.14、16.93，P=0.002、0.001、0.007、0.000；与LPS组相比，t=8.18、10.95、5.34、10.68，P=0.001、0.001、0.006、0.001），见图4。

图4 IL-18Bp对LPS诱导TCP小鼠IL-18、TNF-α等炎症因子表达的影响Fig 4 The effect of IL-18Bp on the expression of IL-18，TNF-α and other inflammatory cytokines in the TCP mice induced by LPS

2.5 IL-18抑制剂对LPS诱导血小板减少小鼠脾脏组织的影响LPS组脾脏组织有炎症细胞因子浸润，对照组、LPS/IL-18Bp组未见明显异常，见图5。

图5 IL-18Bp对LPS诱导TCP小鼠脾脏组织的影响（200×）Fig 5 The effect of IL-18Bp on the spleen tissue of TCP mice induced by LPS（200×）

3 讨论

脓毒症是指宿主对感染产生的免疫失控反应，进而发生器官功能障碍，是目前急危重症患者死亡的主要原因，亦是全球医疗健康体系最主要的问题之一[13-15]。据统计，约66.7%的脓毒性休克患者会合并不同程度的血小板减少，并且约有5%~20%的患者进展为严重血小板减少[16-17]。ICU患者血小板减少30%是死亡的独立危险因素，不依赖于疾病的严重程度或器官衰竭的数目，同危重病评分具有同等预测死亡率的价值[1]。然而目前关于血小板计数在脓毒症患者中减少的机制尚不清楚。

IL-18是一种参与机体感染和炎症起始免疫反应的重要促炎细胞因子[18]。多项研究显示，IL-18与脓毒症具有相关性，并且前期临床研究显示，外周血IL-18的表达量与脓毒症患者血小板减少程度呈负相关[8，19-20]。本研究制备了LPS诱导小鼠血小板减少模型，并通过添加IL-18Bp干预，探讨IL-18与脓毒症并发血小板减少的关系。

本研究表明，小鼠单次腹腔注射LPS后血小板计数开始下降，且LPS组72 h生存率仅为52%，提示血小板减少模型构建成功。本实验还观察到IL-18Bp的干预能够显著增加LPS诱导小鼠血小板减少模型的72 h生存率，说明抑制IL-18对LPS诱导小鼠血小板减少模型具有一定的保护作用。为进一步探究IL-18Bp对LPS诱导小鼠血小板减少模型的具体保护作用，笔者对其血小板计数、血小板活化以及IL-18等炎症因子和免疫器官脾脏的组织病理进行了检测分析。

由于在前期研究中，笔者对30 mg/kg LPS单次腹腔注射诱导血小板减少小鼠模型血小板减少的发生率为96.7%，并对血小板计数进行了监测，发现在LPS注射后2 h左右可发生血小板减少，24 h时血小板计数达到最低值，之后血小板计数会逐渐回升，故此次采用IL-18抑制剂干预LPS诱导血小板减少小鼠时，着重观察了LPS注射后24 h时血小板计数等各项观察指标的变化。结果显示，IL-18Bp不仅能够缓解LPS诱导的小鼠血小板计数的减少，而且能够减少LPS刺激引发的血小板活化标记物sCD40L的表达，提示IL-18Bp能够在一定程度上减少LPS诱导的血小板活化。除此之外，笔者还观察到在给予小鼠IL-18Bp干预后，LPS诱导血小板减少小鼠体内IL-18表达量减少，同时IL-6、IL-10和TNF-α的表达量也较未使用IL-18Bp干预的LPS诱导血小板减少小鼠减少，同时脾脏病理分析结果显示LPS刺激后的脾脏有明显的炎症因子浸润，而IL-18Bp干预的小鼠脾脏未见明显异常，这些观察结果均提示IL-18Bp干预能够在一定程度上抑制LPS刺激引发的小鼠的炎症反应。

综上所述，IL-18Bp对LPS诱导血小板减少小鼠具有一定的保护作用，能够在一定程度上缓解LPS诱导血小板减少小鼠的血小板计数减少、血小板活化和炎症反应，但其具体的分子作用机制仍需进一步研究。