廿烷五烯酸单药和联合用药诱导肺癌细胞凋亡作用原理的研究

李星 安京华

【摘要】目的：研究廿烷五烯酸在单药和联合用药时对肺癌细胞诱导凋亡作用的可能原理。 方法：应用酶标仪检测肺癌细胞的活性氧水平。结果：通过检测肺癌细胞内活性氧（reactive oxygen species， ROS）水平可知，相比卡铂组与对照组而言，EPA组和联合组可明显提高细胞内ROS水平。结论：单独使用廿烷五烯酸或用联合卡铂治疗均可使肺癌细胞内活性氧水平明显升高，从而使bcl-2表达减弱，可能是肺癌细胞凋亡现象增加的原理之一。

【关键词】廿烷五烯酸；卡铂；A-549细胞；ROS

[中图分类号]R734.2 [文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2021）03-0033-02

The study on mechanism of induced apoptosis by eicosapentaenoic acid monotherapy and combination therapy

LI Xing1， AN Jing-hua2 （1. Yufa Town Central Hospital ， Daxing Beijing 102602， China； 2. YanBian University Hospital ， Yanji Jilin 133000， China）[Abstract] Objective： To explore the mechanism of induced apoptosis by eicosapentaenoic acid and carboplatin. Methods： Microplate assay was used to determine Reactive oxygen species （ROS） level of human lung cancer cell line A-549. Results： The level of ROS in EPA group and combined group were significantly higher than those in control group and carboplatin group. Conclusions： ROS lever of EPA group and combined group were obviously increased. expression of bcl-2。That maybe increase the apoptosis of lung cancer cells because ROS can reduce expression of bcl-2.

[Key words] Eicosapentaenoic acid； A-549； ROS

廿烷五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA）属于ω-3多不饱和脂肪酸。PUFAs具有良好的抗癌特性。二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）是一类具有生物活性的大分子，它们的抗癌作用是多样性的。这些多不饱和脂肪酸具有较高的安全性，在体内外均可部分选择性地诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞生长。它们还通过增加不同细胞系对特定抗肿瘤药物的敏感性来提高化疗药物的疗效。这些ω-3多不饱和脂肪酸具有多种抗癌作用，但确切的机制尚不清楚。尽管许多研究已经探讨了DHA和EPA对实体瘤的作用及其机制，但对于这两种FAs在血液恶性肿瘤中的作用及其机制还没有达成共识。目前已有实验表明ω-3 多不飽和脂肪酸在肿瘤疾病的治疗中有作用[1-3]，但其抗肿瘤的具体原理尚处于研究中。本次实验旨在通过使用EPA单药和联合用药的不同情况下，研究其诱导肺癌细胞凋亡增加的可能原理。

1 材料与方法

1.1细胞系 人肺癌A-549细胞株（北京首都医科大学惠赠）常规培养于DMEM 培养液中（含10%新生小牛血清），选对数生长期的细胞进行实验。

1.2主要试剂 EPA：购自美国SIGMA公司；卡铂：购于齐鲁制药有限公司；DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium） 培养基购于美国GIBCO，4℃冰箱保存备用；新生小牛血清（Newborn Calf Serum）：武汉三利生物技术有限公司，置于56℃恒温水浴箱30min灭活补体，-20℃冰箱保存； ROS试剂盒：购于碧云天生物公司。

1.3酶标仪检测细胞ROS水平 将A-549细胞制成1×105个/mL细胞悬液，置于六孔板中培养。设立对照组，EPA组（EPA 80μg/mL），卡铂组（卡铂100μg/mL），联合组（EPA 80μg/mL、卡铂 100μg/mL），每种药物浓度设6个平行孔，继续培养48h。光密度值（OD值）使用酶标仪进行检测。实验重复三次，取平均值。OD值即可反映细胞内ROS水平。

1.4统计学分析 使用SPSS18.0进行数据分析。数据以均数±标准差（_x±s）表示，两组间比较采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1酶标仪检测细胞ROS水平 通过实验结果可知，用药48h后，卡铂组与对照组细胞内ROS水平变化无显著性差异，而EPA组和联合组则明显提高细胞内ROS水平，详见表1。

3 讨论

PUFAs是一大类脂肪酸（FAs）的成员，在其结构中具有多个双键。众所周知，这些具有生物活性的大分子具有细胞正常功能所需的各种重要生理作用。这些FAs的许多作用是通过其更活跃的长链代谢物介导的，这些代谢物通过改变质膜组成、产生各种炎症介质和改变不同基因的表达而起作用。EPA和DHA是长链多不饱和脂肪酸（pufa）中的一种，已显示出多种健康益处。这些FAs通过调节包括血压、凝血、心律和心率在内的多种危险因素来降低心血管疾病的风险、抗炎和免疫调节作用，其次，这些FAs对多种代谢途径的调节也有一定的作用，使其在治疗炎症疾病、代谢紊乱（如2型糖尿病）和免疫损害条件中具有潜在的治疗利用价值。长期食用含EPA的食物可显著增加血浆、血小板和红细胞中EPA的含量，且EPA对恶性细胞都有选择性作用，对正常细胞的影响较小。EPA的抗肿瘤作用的机制之一是诱导脂质过氧化。其中，保护细胞免受脂质过氧化的主要细胞内机制是GP-x4酶，不同细胞系对EPA的敏感性可能反映了GP-x4在不同健康细胞和肿瘤细胞中的差异表达。这将影响保护细胞免受过氧化损伤的能力。

有关研究报告显示，体外EPA处理HL-60和K-562细胞后，G0/G1期细胞周期延长，G2/M期缩短，两种细胞株的坏死率分别为19.6%和4.4%；此外，EPA在HL-60细胞中诱导凋亡的程度更大，其主要通过下调凋亡的主要调节因子bcl-2信号分子的表达来介导，表明EPA（40、60和120μM）可诱导HL-60细胞凋亡，但K562细胞不受EPA对DNA断裂的影响。尽管不同的EPA敏感和抗EPA白血病细胞系表达不同水平的促凋亡和抗凋亡因子，如c-myc和Bcl-2，但这些因子表达的差异并不能解释其对不同细胞凋亡的不同影响。

此外，一项研究显示，EPA对两种淋巴瘤细胞株Raji和Ramos有诱导坏死和凋亡的作用。使用不同的抗氧化剂逆转EPA的坏死作用，但对其凋亡作用没有任何影响，表明氧化应激是EPA诱导坏死的一种手段。EPA诱导的Ramos细胞凋亡是通过EPA对凋亡内在途径的直接作用而不是干扰细胞周期的进展来介导的。三氮杂合酶C是一种酰基辅酶a合成酶（ACS）抑制剂，它的应用揭示了ACS在EPA诱导的细胞凋亡中的重要作用。使用不同的抗氧化剂逆转EPA的坏死作用，但对其凋亡作用没有任何影响，表明氧化应激是EPA诱导坏死的一种手段。EPA诱导的Ramos细胞凋亡是通过EPA对凋亡内在途径的直接作用而不是干扰细胞周期的进展来介导的。三氮杂合酶C是一种酰基辅酶a合成酶（ACS）抑制剂，它的应用揭示了ACS在 EPA诱导的细胞凋亡中的重要作用。实体瘤患者的I期和II期临床试验结果表明，omega-3 FAs是安全的，并且显示出有希望的结果，特别是在治疗后这些FAs的血浓度显著升高的患者中应用；需要注意的是，EPA改善癌性恶病质的推荐剂量为1.5-2g/天，该剂量的副作用很小，然而，增加剂量的益处尚不清楚。尽管多不饱和脂肪酸增加氧化应激和细胞内脂质过氧化物自由基的产生使其易受氧化损伤这一事实临床上有所争论，但多不饱和脂肪酸的消耗已被证明是临床安全的。

有研究显示，癌细胞内ROS水平升高，可形成高氧化应激状态，减少抗凋亡因子bcl-2的表达 [4]，从而增加癌细胞的凋亡现象。在本实验中使用活性氧检测试剂盒检测肺癌A-549细胞中ROS水平，可以发现联合组和EPA组与对照组或卡铂组相比较，联合组和EPA组能显著引起肺癌A-549细胞内ROS水平升高，且联合组升高更明显。因此推测，当EPA单药或联合卡铂时，肺癌细胞内产生大量活性氧，减少了抗凋亡因子bcl-2的表达，从而引起肺癌细胞凋亡，为EPA本身及增强卡铂抗癌作用的原理之一。

参考文献

[1] 楼健颖， 吳丹， 林汉庭， 等. ω-3多不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸对胃癌细胞株AGS生长和增殖的影响[J]. 中华普通外科杂志， 2007， 22（8）： 613-615.

[2] 秦薇， 朱圣陶. 二十二碳六烯酸对人胰腺癌细胞增殖的抑制[J].中华临床营养杂志， 2009， 17（1）： 49-52.

[3] 李星， 安京华， 石俊， 等. ω-3多不饱和脂肪酸廿烷五烯酸单剂以及联合卡铂对人肺腺癌A-549细胞系增殖和凋亡的影响[J].中华临床营养杂志， 2012， 20（1）： 30-32.

[4] Mao Y， song G， Cai Q， et al. Hydrogen peroxide-induced apoptosis in human gastric carcinoma MGC803 cells[J]. Cell Biol Int， 2006， 30（4）： 332-327.

作者简介：李星，北京市大兴区榆垡镇中心卫生院。E-mail：lix0226@163. com