T2DM心肌纤维化与miRNAs靶点endoglin关联性研究△

湛 慧 陈秋玲 李 宽

(深圳市人民医院药学部 深圳 518000)

microRNAs是由20～23个核苷酸构成的天然调节因子，它通过主抑制mRNA翻译或促进分解来达到调节作用。多项研究显示，miRNAs在心血管领域特别是心肌纤维化方面发挥着重要作用[1～3]。miRNAs可激活多个通路，促正常成纤维细胞出现病理分化，观察miRNA-21的表达水平以及纤维化标志物的变化，发现Ⅰ型胶原与纤维连接蛋白呈现一定的相关性[4]。miRNA-29b可对结缔组织生长因子、基质金属蛋白酶、I型胶原起到负性调节效果，而达到调节心肌纤维化进程[5]。研究表明，在心肌肥大模型中，miRNA-1和miRNA-133可以调节异常的表现，另外也可调控心肌细胞的凋亡[6]。因此，通过miRNA在心肌纤维化领域的机理或许能为临床治疗新的目标靶点。mRNA调控的复杂性，目前对miRNA的研究还处于探索阶段，因此，本研究希望发现更多与心肌纤维化相关的miRNA。

1 实验方法

选取40只雄性C57BL/6小鼠，按照随机数字原则进行分组：对照组10只、DM组30只。DM组腹腔注射STZ(40mg/kg/D)5d做T2DM建模，对照组不做特殊处理。处死小鼠后，取两组小鼠部分心肌组织用于制作组织切片，放入4%多聚甲醛中，并采用Masson、HE染色处理。采用酒精脱水处理后，制作为蜡片，所有蜡片为4μm薄片，并经40℃热水进行预热并做烫平处理，然后放入45℃恒温箱子中晾干后，保存于4℃环境。

1.1 HE染色

切片进行烘烤处理，烘烤温度60℃，时间为1h，依次放入二甲苯I、二甲苯Ⅱ、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇和70%乙醇，最后用蒸馏水冲洗。依次采用苏木素、伊红染液作染色处理，脱水后采用中性树脂进行封片处理，并经光镜查看，及时拍照记录。

1.2 Masson 染色

将切片于60℃烘烤1h，脱蜡至水。用铁苏木素、蓝化液、丽春红染液和苯胺蓝依次染色，脱水后用中性树脂封片，再用光镜观察并拍照记录。

1.3 Western-blot

完成组织总蛋白的提取，取少量心脏末端，放入先配制的组合分解液，研磨30s后，将EP管置于冰上0.5h，于4℃环境下作离心处理，离心时间为10min，离心转速为12000rpm，保存在-80℃环境下，再计算吸光度值、检测蛋白浓度。调配浓缩胶与分离胶，制备好的蛋白质样品经SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳。样品两端分别放入5μL蛋白标记物，保留30min后，待Marker完全分开且目的蛋白跑到合适位置后，结束电泳，进行转膜，再封闭1h。一抗孵育和二抗孵育结束后，在显影液中将膜浸泡1 min进行显影，并用软件分析灰度值。

1.4 RNA提取

将心脏末端分别加上1mL Trizol，研磨30s后，转移到1.5mL EP内，在冰上分解10min，分别加上200μL的氯仿15s剧烈晃动，变成乳浊液，用12000rpm，离心5min，离心环境44℃，按照1∶1比例加入等量上清异丙醇，按照12000 rpm速度、离心10min，放入适量DEPC水溶解进行沉淀，检测浓度、纯度，设置空白对照组DEPC水，纯度标准为A260/A280时为1.8～2.0时。

1.5 RNA逆转录

去除DNA：

试剂组分体积(μL)4 × gDNA wiper Mix4primer1模板RNATotal RNA:1pg-1μgRNase free dd H2Oto 16

逆转录反应：

试剂组分体积(μL)5x HiScript II qRT SuperMix II4第一步反应液16

引物序列：

引物名称序列(5’-3’)miRNA-138-5p RTCTCGCCAGTCTCCCGAGCGGCGCCCTACACTGGATACGACCGGTTCGCCTU6 RTCCCCCACCACACTGAATCTCTGCC

PCR扩增：

试剂组分体积(μL)2×SYBR10模板c DNA(稀释2倍)2Forward primer1Reverse primer1RNase free ddH2O6

目的基因引物序列：

GenesForward primerReverse primermi RNA-138-5P5’-GAGGCTAGCTGGCCCGTTTC-3’5’-TGGCCAAGGTCATCCATGACA-3’U65’-AGCTCACTGGCATGGCCTTCGCG-3’5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’CollagenⅠ5’-GGACCTCATGGCCCACATGG-3’5’-TACAGGTTGAAGAGCTTCTGGC-3’CollagenⅢ5’-GGAAGAGAGAGACCCTCACT-3’5’-CGACAGCTGACTTGCTGAGA-3’Endoglin5’-GGACCTCATGGCCCACATGG-3’5’-TCATCCATGACAACTTTGGT-3’GAPDH5’-AGGAAGAGAGAGACCCTCATGC-3’5’-GACTGTGGATGGCCCTGCTC-3’

2 实验结果

结果观察显示，红色为正常心肌细胞，期间可见散装分布的胶原纤维，呈蓝色。在对照组中可见完整良好的心肌结构，紧密且规律，形态完好；相比之下，DM组可见病理性特征，细胞排练紊乱，间质疏松，可观察到炎性细胞浸润和纤维细胞增生。正常对照组心肌组织胶原纤维少，分布均匀，见图1 。

图1 HE染色及Masson染色分析小鼠心肌组织病理变化

免疫组化结果显示，DM组小鼠心肌组织中CollagenⅠ、CollagenⅢ及Endoglin蛋白可见异常表达，分别升高了0.63倍、1.06倍和1.16倍，结果有统计学差异，见图2 A和B；相比于对照组，DM组中CollagenⅠ、Collagen Ⅲ及Endoglin的mRNA表达异常，水平分别为CON组的1.36倍、0.79倍和1倍，结果有统计学差异(P<0.05)；DM组miRNA-138-5p的水平较CON组下降了68.7%，结果有统计学差异(P<0.05)，见图2C和D。

图2 免疫组化结果分析

3 讨论

根据流行病调查，糖尿病发病率逐年升高，随着病情恶化发展，糖尿病患者并发症发生率增加，其中一个常见的并发症为心肌纤维化，会加重患者致死率[7]，表现为大量心肌成纤维细胞。心肌纤维化的发病机制可理解为：在TGF-1/Smads信号路径上，首先TGF 1与T受体RⅡ结合形成二聚体，激活T受体RI被激活，与TGF-1结合，作用于Smads蛋白的C端，也就是丝氨酸残基。当激活磷酸化后，Smad2/3以及Smad4被激活形成转录复合物[8～10]。内分泌素(Endoglin，CD105)主要处于内皮细胞[11]，为转化生长因子超家族TGF-的Ⅲ型辅助受体[12]。该激素为TGF-的辅助受体，通过作用于TGF下游的调控途径，参与胶原I的合成，从而促进心肌纤维化[13]。内分泌素通过心肌成纤维细胞中的TGF-I受体，同时产生激活和抑制Smad1&5的双重作用，平衡TGF信号通路平衡[14]。我们推测并验证Endoglin可能会作为必要信号因子抑制TGF-1信号转导，而这一过程是选择性的，在Human-CFs(人心肌成纤维细胞)TGF-1信号转导中抑制胶原蛋白合成，从而减轻心肌纤维化[15]。

近年来，miRNA-138-5p的研究主要集中在口腔癌，胰腺癌、肺癌等癌症研究领域[16～18]，但罕见于心肌纤维的报道。研究显示一个microRNA可以有多个靶点，同一靶点基因也可以受到多个microRNA的生物学调控。因此，Endoglin可能是miRNA-138-5p的调控靶点，并影响心肌纤维化。