木质纤维素降解复合菌系筛选与鉴定

孙苗苗，李 娟，刘国庆，周春阳，韦张其，吴建鑫

（1.合肥工业大学食品与生物工程学院，合肥 230601；2.空军第一后勤训练基地烹饪教研室，上海 200443）

随着木质纤维素生物降解机理研究的不断深入，在生物降解过程中微生物间的协同关系也逐渐受到人们的重视，虽然纤维素的生物降解已研究了很长时间，但为了提高木质纤维素的降解效率，不同领域的研究学者已经进行了大量的科研工作。近年来研究发现，木质纤维素降解需要经过2种或更多种微生物的组合来完成，单一的微生物却只能发挥微弱作用甚至没有作用［1］。因此，人们越来越关注微生物混合培养或混合发酵，如Haruta等［2］富集筛选得到一组能够有效降解稻草的复合菌系，该菌系在4 d时稻草降解率达60%。Wongwilaiwalin等［3］得到一组能够有效降解工业蔗渣、稻草、工业桉树纸浆的高温纤维素降解复合菌群。目前国内也有许多学者致力于木质纤维素降解复合菌系的研究，杜然等［4］构建一个降解纤维素的兼性厌氧复合菌系培养72 h可使滤纸失重90%，且发酵3 d乙醇积累浓度可达1.54 g/L。刘爽［5］构建的复合菌系在216 h内稻草降解率达75%。崔宗均等［6］以4种高温堆肥为原料构建了一组高效稳定的纤维素分解菌复合系MC1，该复合系8 d可将水稻秸秆完全降解。Wang等［7］通过限制性培养技术获得了一组50℃静置条件下培养的木质纤维素快速降解复合菌系，培养3 d内滤纸完全降解。利用类似的方法，Qin等［8］、Zhang等［9］、李维华等［10］也获得具有木质纤维素降解能力的复合菌系，均表现出较好的降解效果。因此，筛选能够降解纤维素的高效复合菌，用于木质纤维素降解复合菌株的使用已成为当前研究的热点［11，12］。

本研究以腐烂的秸秆为主要原料，利用纤维素刚果红培养基分离纯化菌系，通过羧甲基纤维素酶活性的测定、滤纸条的降解试验、菌株的复筛（滤纸条酶活、CMCase酶活测定）来选出高效微生物群系，构建复合菌系，并进行传代培养，选出高效微生物群系，之后进行筛选检测，确定微生物群系的组成。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 宣城市宣州区合肥工业大学周边田地腐烂的玉米秸秆。

1.1.2 试剂

1）DNS试剂。酒石酸钾钠18.2 g，溶于50 mL去离子水中，加热后，依次加入3，5-二硝基水杨酸0.63 g，NaOH 2.1 g，苯酚0.5 g，搅拌至完全溶解，冷却后用去离子水定容至100 mL，于棕色瓶中7 d室温保存。

2）pH 4.8柠檬酸缓冲液（0.05 mol/L）。分别称取10.51 g柠檬酸、14.71 g柠檬酸钠，各自定容至500 mL，即为0.1 mol/L的柠檬酸和柠檬酸钠溶液。取柠檬酸溶液和柠檬酸钠溶液各11.5 mL，混匀后加入去离子水至50 mL，即为0.05 mol/L的pH 4.8柠檬酸缓冲溶液。

3）0.51%CMC-Na溶液。称取0.51 g CMC，添加适量的0.05 mol/L柠檬酸缓冲溶液，加热溶解定容至100 mL，用前充分摇匀。

4）葡萄糖标准溶液（1 mg/mL）。称取1 g葡萄糖，加入去离子水定容至1 L，即为1 mg/mL葡萄糖标准溶液。

1.1.3 培养基

1）纤维素刚果红培养基。CMC-Na 2.0 g/L，（NH4）2SO42.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，K2HPO41 g/L，Mg-SO4·7H2O 0.5 g/L，刚果红0.4 g/L，琼脂12 g/L，pH 7.0。

2）滤纸条崩解培养基［13］。（NH4）2SO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，酵母膏0.1 g/L，滤纸条（1 cm×6 cm）1条/试管，pH 7.0。

3）羧甲基纤维素钠培养基。CMC-Na 10 g/L，蛋白胨2 g/L，NaCl 0.5 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，酵母膏0.5 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0。

4）发酵产酶培养基［14］。玉米秸秆粉20 g，NH4NO34 g，K2HPO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，无水CaCl20.4 g，NaCl 0.5 g，去离子水1 000 mL，pH 6.0。

5）CMC-Na固体培养基。CMC-Na 15 g，NH4NO31.0 g，酵母膏1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41.0 g，去离子水1 000 mL，加入琼脂20 g。

6）PDA培养基。马铃薯浸汁（20%）100 mL，琼脂2 g，葡萄糖2 g，pH 7.0。

7）高氏合成1号培养基。可溶性淀粉2.0 g，KNO30.1 g，K2HPO4·3H2O 0.05 g，FeSO4·7H2O 0.001 g，NaCl 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，pH 7.2～7.4，琼 脂1.5～2.0 g，去离子水100 mL。

1.1.4 主要仪器 DHG-9145A型电热鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司；722型可见光分光光度计752N，上海仪电分析仪器有限公司；PHS-25型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；JW-3021H型高速离心机，赛默飞世尔科技有限公司；THZ-82A型数显气浴恒温振荡器，常州市金坛科兴仪器厂；BM1000型生物显微镜，南京江南永新光学有限公司；YXQ-LS-50S11型立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司；DHP-9082型电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；FD-15-T-500A型中药材高速粉碎机，上海市闵行区舰艇工贸有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的处理与初筛

1）样品处理。准确称取秸秆样品10.0 g，加入到盛有90 mL无菌生理盐水且带有玻璃珠的250 mL三角瓶中，于37℃恒温摇床摇动，将样品充分混匀打散3 h备用。

2）初筛纯化。首先，将采集的样品用无菌水逐级稀释至10-6、10-7和10-8倍后，分别取0.1 mL涂布于纤维素刚果红选择性培养基上，每个浓度重复涂布3个平板，28℃培养，定期观察，挑取菌落周围出现清晰透明圈的菌株；然后，通过划线分离纯化所挑取的菌株，直至得到单菌落。

1.2.2 羧甲基纤维素酶活性的测定

1）将纯化后的菌株进行筛选，选择生长状况较为良好的菌株，初步根据显微镜下形态观察确定菌株的种属。

2）将霉菌和放线菌制成菌悬液分别涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基和高氏1号培养基上，待霉菌菌落和放线菌菌落长出后，用打孔器取6 mm的菌饼，接种于纤维素刚果红平板，而细菌则直接采取点接的方式接种于纤维素刚果红培养基上，在28℃恒温培养箱中培养3～5 d，观察并测量透明圈的直径；酶活高低的判断则通过透明圈直径（D）与菌落直径（d）的比值进行初步判断。

重量控制系统基本原理是根据烟支实时重量，对平准盘高度进行调节来控制烟支重量，是一种典型的滞后控制系统。系统采用PID控制算法进行控制。

1.2.3 滤纸条崩解试验 将筛选出的具有高CMCase活性的菌株进行活化，分别取1 mL接种于装有20 mL的滤纸条崩解培养基的试管中（每根试管放入2条滤纸条（每条6 cm），培养10～12 d，定期观察滤纸条崩解情况［15］。

1.2.4 菌株的复筛

1）葡萄糖标准曲线的绘制。取8支洁净的具塞试管进行编号，并按照表1的要求依次加入溶液，绘制葡萄糖标准曲线。分别取葡萄糖标准液（1 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于20 mL试管中，用去离子水将每支试管补加至2.0 mL，将去离子水与标准葡萄糖标准液的混合溶液充分摇匀后，分别准确加入DNS试剂2.0 mL，摇匀后沸水浴5 min，流水冷却，用去离子水补足至20 mL。在540 nm处测定吸光度，以第1支试管进行调零，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

表1 葡萄糖标准液的配制

2）粗酶液的制备［16］。将通过挑选的菌株制成菌悬液，分别取2 mL菌悬液加入装有50 mL发酵培养的150 mL三角瓶中。30℃、160 r/min，摇床培养3 d，获得的培养液8 000 r/min离心15 min，所获得的上清液即粗酶液。

3）酶活的测定［17］。①滤纸条酶活。取3根20 mL的具塞试管，分别向其中加入0.5 mL的粗酶液、1.5 mL的柠檬酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 4.8），向第1支试管中加入2.0 mL DNS试剂，摇匀并放入50℃水浴锅中预热5 min。各加入1条6 cm滤纸条，摇匀，50℃反应60 min，取出后立即在第2、第3试管中加入2.0 mL DNS试剂，摇匀，沸水浴5 min。取出冷却至室温，摇匀。以第1支试管为空白，在540 nm处测定吸光度。

②羧甲基纤维素酶活。取3根20 mL的具塞试管，分别向其中加入1.5 mL的0.51%CMC柠檬酸缓冲液，各加入0.5 mL酶液，向第1支试管中加入2.0 mL DNS试剂，摇匀并放入50℃水浴锅中预热。50℃反应30 min。取出后除第1支试管外都加入2.0 mL的DNS试剂终止酶反应。之后摇匀并沸水浴5 min，取出冷却至室温，摇匀。以第1支试管为空白，在540 nm处测定吸光度。酶活的单位与滤纸条酶活类似。

1.2.5 菌株的鉴定 将挑选出来的菌株首先采用形态观察鉴定，之后根据它们的DNA序列和ITS序列比对进行鉴定。

1）形态观察。①采用划线分离，挑取单菌落划线于不同的培养基上，让各菌株在适宜生长温度下培养（细菌和放线菌28℃培养，真菌在30℃培养），观察菌落的生长状况，并做好记录。②对生长良好的菌株进行镜检观察，观察其在显微镜下的形态特征，并拍照记录。

2）序列比对鉴定。首先采用细菌基因组提取试剂盒提取细菌和放线菌总DNA，采用真菌基因组提取试剂盒提取真菌总DNA。

①细菌16SrDNA序列扩增。采用338F（5′-AC TCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）与806R（5′-GGAC TACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物扩增细菌菌株16S rDNA序列。PCR反应体系：Phusion®Hot Start Flex 2X Master Mixart Version 12.5μL、Forward Primer 2.5μL、Reverse Primer 2.5μL、模板DNA 50μL、ddH2O 25μL。PCR反应条件：98℃预变性30 s；98℃变性10 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，35个循环；最后72℃延伸10 min；4℃保存。将扩增后的DNA进行凝胶电泳检测，观察目的条带是否存在并符合要求。

②真菌ITS2序列扩增。采用fITS7（5′-GTG ARTCATCGAATCTTTG-3′）与ITS4（5′-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3′）引物扩增真菌菌株ITS序列。

PCR反应体系：Phusion®Hot Start Flex 2X Master Mixart Version：12.5μL、Forward Primer 2.5μL、Reverse Primer 2.5μL、模板DNA 50μL、ddH2O 25μL。PCR反应条件：98℃预变性30 s；98℃变性10 s，54℃退火30 s，72℃延伸45 s，35个循环；最后72℃延伸10 min；4℃保存。将扩增后的DNA进行凝胶电泳检测，观察目的条带是否存在并符合要求。

2 结果与分析

2.1 初筛结果

2.1.1 分离纯化结果 通过纤维素刚果红培养基的涂布培养，选择出24株生长较好的菌株对其编号，进行分离纯化并选择出几株菌株的生长情况，如图1所示。从菌落形态可以初步判断多数菌为霉菌、放线菌和少量的细菌。

图1 部分单菌落生长情况

2.1.2 刚果红初筛结果 将分离纯化后生长迅速的菌株分别采取打孔、点接的方式进行刚果红培养筛选，观察并测量其透明圈的直径和菌落直径。测量结果如表2所示，根据透明圈直径与菌落直径的比值大小，选择出A1、A3、A4、N1、C1、G3、P1这7株菌株进行滤纸条崩解试验。在这7株菌株中C1、N1这2株菌株的纤维素酶活较为明显。

表2 菌落直径与其对应透明圈直径大小汇总

由图2可以看出，菌株羧甲基酶活的高低与菌株直径、透明圈直径的测量比值结果相一致。

图2 刚果红透明圈初筛结果

2.1.3 滤纸条崩解试验结果 根据滤纸条的降解情况判定符合条件的菌株。从图3可以看出，多数滤纸条的降解程度不完全，处于滤纸条周边出现毛边的情况；部分是3/5发生降解；较少部分发生完全降解。发生降解的只是少部分，可能是只以滤纸条为碳源，其微生物需要的生长碳源供给不足。

图3 滤纸条崩解试验结果

2.2 复筛结果

1）葡萄糖标准曲线。所绘制葡萄糖标准曲线（图4）的R2=0.999 3，说明该标准曲线的拟合程度好，可以用于试验结果的计算。

图4 DNS试剂测定葡萄糖标准曲线

2）滤纸酶活与CMCase酶活。根据滤纸酶活与CMCase酶活的测定方法，得到的菌株酶活如表3所示。从表3可以看出，A3、N1、C1这3株菌株的滤纸酶活较大，且其所对应的CMCase酶活也相对较大。可能是因为筛选过程菌株没有达到最优的结果，以及在粗酶液制备过程的培养时间不够。

表3 菌株酶活力 （单位：U/mL）

2.3 菌株鉴定结果

2.3.1 形态鉴定结果 将酶活较大的几株菌株经过CMC培养基划线分离纯化培养后得到不同的菌落，如图5所示。根据菌落形态可以初步看出，部分菌落表面有菌丝，颜色呈现白色；有的菌落看起来为偏黄色，有酒香味；有的形成质地致密的小菌落，干燥、不透明、难以挑取，菌落表面为粉末状或颗粒状。

图5 单菌落形态鉴定

2.3.2 菌株镜检结果 显微镜观察结果如图6所示。从图6可以看到，镜检下的菌丝交织在一起，呈网状，假性分支，树枝状，无规则发散蔓延生长，有明显节状。

图6 菌株镜检结果

2.3.3 分子生物学鉴定

1）将扩增后的DNA进行凝胶电泳检测，得到的序列电泳如图7所示，序列1、序列2、序列4为所挑选菌株目的条带片段。由引物338 F和806 R PCR扩增得到的目的片段长度约为469 bp，为了满足建库的需要，需对引物进行修饰，合成带有测序用接头的引物，因此，实际电泳得到的片段长度更长。

图7 细菌菌株16Sr DNA序列电泳结果

2）将扩增后的ITS进行凝胶电泳检测，得到的序列电泳如图8所示，序列1、序列3为所挑选菌株目的条带片段。由PCR扩增得到的目的片段长度约为353 bp，为了满足建库的需要，需用带有测序用接头的引物，因此，实际电泳得到的片段长度更长。

图8 真菌ITS序列电泳结果

3）ITS序列的系统发育树构建。利用MEGA软件进行ITS序列同源性比对，将菌株的ITS基因序列测得的DNA单链碱基序列提交NCBI中进行在线BLAST同源比对后绘制菌种发育树（图9）。该菌株鉴定后结果显示为栓菌（Trametes）、被孢霉（Mortierella）、稻瘟病菌（Sarocladium）、未分类的真菌（Fungiunclassified），其中，与稻瘟病菌的同源性较高，为83%。

图9 ITS序列的系统发育树构建

4）16S rDNA序列的系统发育树构建。利用MEGA软件进行ITS序列同源性比对，并采用N-J法构建系统发育树，将该菌株的16SrDNA基因序列与NCBI现有数据库进行BLAST序列比对，如图10所示。该菌株鉴定后结果显示为未分类的链霉菌（Streptomycetaceaeunclassified）、未分类的放线菌（Actinomycetalesunclassified）、丙酸杆菌（Propionibacterium）、链霉菌（Streptomyces）、未分类的细菌（Bacteriaunclassified）。其中，与链霉菌的同源性为87%。

图10 16Sr DNA序列的系统发育树构建

3 小结

本次试验仅研究了构建高效复合菌的方法，并通过刚果红纤维素培养基初筛、滤纸条降解试验、酶活测定复筛等构建出一批相对高效的菌系，但是构建复合菌的方法多样以及不同木质纤维素降解特性不同，还需要更加深入地研究和探讨。