杨凌某牛场犊牛腹泻病细菌的分离鉴定及药敏试验

仇薪鑫，牛华锋，贾燕青，张振仓(杨凌职业技术学院，陕西 杨凌 712100)

随着中国人民对牛肉需求量的不断增加，肉牛养殖规模也逐年扩大，而大规模养殖带来的疾病风险也随之增加。犊牛腹泻是一种严重影响犊牛生长发育、成活的胃肠道疾病，具体表现为高热、精神萎靡、持续腹泻，发病率极高，死亡率可达50%以上[1-2]。而在肉牛养殖过程中，对犊牛腹泻的有效防治能够极大地减少其经济损失。2019年10月，杨凌示范区某肉牛养殖场发生犊牛腹泻病例，临床表现为犊牛排灰黄色水样稀粪，混有血丝，体温升高至40 ℃～41 ℃。剖检发现，小肠黏膜点状出血，肠系膜淋巴结出血肿大，肝肾颜色变浅。本试验通过无菌采集发生腹泻的秦川犊牛粪样，对其进行细菌学分离鉴定和药物敏感性试验分析，确定引起犊牛腹泻的病原菌种类并为临床合理应用抗生素及制定防治措施提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

病料来源：陕西杨凌示范区某肉牛场腹泻犊牛的粪样。

药敏纸片购于杭州滨河微生物试剂有限公司；沙门氏菌标准血清购于兰州生物制品研究所；试验用小鼠源于西北农林科技大学动物医学院。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 无菌采集发病犊牛粪便样品，用灭菌生理盐水按1:1比例涡旋混匀，离心取上清，用于病原分离培养。

1.2.2 细菌分离培养 所用培养基按照参考文献[3]制备。

取病牛粪便涂片，无菌接种于血琼脂平板上，记录菌落特征。选择单菌落进行革兰氏染色镜检，观察可疑致病菌的细菌形态。将单个可疑致病菌菌落分别培养于普通琼脂平板和麦康凯平板上，再用亮绿胆盐-四硫磺酸钠肉汤培养基进行增菌培养，在肠道鉴定培养基上划线分离，置37 ℃培养24 h。挑取麦康凯平板上的红色菌落或血平板上有溶血现象的典型菌落，以及鉴定培养基上疑似沙门氏菌的菌落进行涂片和染色镜检，与之前观察到的细菌进行比较，如果相同，则进行纯培养；如果不同，则重新接种。将分离到的纯培养物分别接种于普通琼脂平板、鲜血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、普通肉汤培养基、伊红美兰培养基和S.S培养基中，37 ℃条件下培养24 h，观察其生长表现。

1.2.3 生化鉴定 将分离的菌纯培养物编号(C1、C2、C3)，分别进行生化试验(糖发酵试验、靛基质试验、MR与VP试验、柠檬酸盐利用试验、三糖铁琼脂斜面试验、硝酸盐还原试验、接触酶试验、精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶试验、明胶液化试验)，每个试验做3次重复。

1.2.4 动物致病性试验 试验动物为8只健康小白鼠，将其随机分为试验组(G)4只和对照组(T)4只。试验组又分为2小组，G1组腹腔注射0.2 mL一定浓度的沙门氏菌血清肉汤纯培养物，G2组腹腔注射0.3 mL一定浓度的大肠埃希氏菌血清肉汤纯培养物，对照组腹腔注射等量的灭菌普通肉汤，隔离饲养12 h，观察其生存状态。

1.2.5 药敏试验 将分离到的细菌纯培养物制成悬液，用灭菌棉签均匀涂布于TSA培养基上，选取多种抗生素的药敏纸片贴于培养基上，置37 ℃恒温培养箱中24 h，测量抑菌环直径。

1.2.6 治疗 结合发病牛场实际情况，将发病犊牛进行隔离治疗，全场实施紧急消毒计划。采用给予适量有效抗生素并补糖、补液、限制饮水、补充维生素C等手段进行综合治疗。分析对比治疗效果，定义治疗后临床病例症状完全消失为显著疗效，治疗后各种临床症状基本消失(未完全恢复正常表现)为基本好转，治疗后临床症状并无明显消失为效果不佳。

2 结果与分析

2.1 分离菌的生化特性

C1菌株：镜检结果为G-杆菌，无芽孢，有荚膜。在普通琼脂平板、血平板、S.S平板、伊红美兰平板上均为圆形、隆起、边缘整齐、光滑、湿润、半透明灰白色小菌落；在血平板上生长良好，不溶血；在麦康凯平板上形成无色透明，圆形小菌落。

C2菌株：镜检结果为G-卵圆形或杆状菌，无芽孢，单个或成双排列。普通琼脂平板、血平板上均为中等大小、圆形隆起、光滑、湿润、边缘整齐、半透明的灰白色菌落；血平板上生长良好，呈β溶血；麦康凯平板上呈光滑、湿润、边缘整齐的红色菌落；S.S平板上为白色小菌落；伊红美兰平板上为圆形黑色、金属光泽菌落。

C3菌株：镜检结果为G-杆菌，散在或成短链，无芽孢，有荚膜。普通琼脂平板上为中等大小、表面光滑、边缘稍整齐、湿润微隆起的淡绿色菌落；血平板生长良好，出现溶血、有特殊气味； 麦康凯平板上形成生长良好、圆形、边缘整齐、光滑的小菌落，产生色素，有特殊气味；S.S平板上整个培养基变成淡黄色，菌落生长良好，无色透明；伊红美兰平板上形成边缘整齐、光滑、湿润、隆起、中等大小的黑色菌落。

2.2 生化试验结果

根据表中结果结合细菌形态特征，确定C1菌株为沙门氏菌，C2菌株为致病性大肠埃希氏菌，C3菌株为铜绿假单胞杆菌[4]。

表1 分离菌的生化特性Table 1 The results of biochemical test of isolated bacteria

Note：“+”means positive;“-”means negative;“⊕”means both acid and gas.

2.3 动物致病性试验结果

对试验组死亡小鼠的肝脏和脾脏进行细菌回归检测，其结果与分离的3株生化试验结果相同，证实小鼠死亡由沙门氏菌和大肠埃希氏菌引起。

2.4 药敏试验结果

结果显示，分离到的沙门氏菌和大肠埃希氏菌均对先锋噻肟、先锋必、菌必治、阿米卡星等抗生素敏感。另外，沙门氏菌对卡那霉素、先锋霉素V、头孢呋肟等抗生素敏感，大肠埃希氏菌对氧氟沙星、环丙沙星、氟哌酸、氯霉素等抗生素敏感。

2.5 综合防治结果

结合试验结果，对10头病情严重的犊牛进行治疗，采取疾病控制措施，通过隔离、消毒，给予适量抗生素(菌必治)和补液等综合防治手段，其中8头发病犊牛治疗效果显著，症状基本完全消失，另外2个病例腹泻症状明显减轻，但未完全恢复，病情基本稳定。

表2 小鼠腹腔注射结果Table 2 Results of intraperitoneal injection in mice

表3 分离菌抗生素敏感试验结果Table 3 The results of antibiotic susceptibility test

表4 治疗前后临床症状对比Table 4 Comparison of clinical symptoms before and after treatment

3 讨 论

本次发病犊牛表现为排水样血便，有黏液，通过进一步细菌分离鉴定，从腹泻犊牛的粪便中分离到了3株细菌，分别为沙门氏菌、大肠埃希氏菌和铜绿假单胞菌。引起犊牛腹泻的致病菌一般以大肠埃希氏菌和沙门氏菌为主，临床表现为精神抑郁、高热、腹胀、腹痛、粪便恶臭发黑，偶有血泡混入[5]。铜绿假单胞菌是一种条件性致病菌，在土壤和水中广泛存在，一旦机体抵抗力降低或皮肤黏膜破损，则会引起全身或局部感染，犊牛往往因发生腹泻，导致机体免疫力降低，而引起铜绿假单胞菌感染发病[6]。通过对分离菌株进行药物敏感试验，结果表明，在临床治疗中可优先选用菌必治、先锋噻肟、先锋必、阿米卡星等抗生素；分离到的沙门氏菌对环丙沙星具有耐药性，很可能是因为长期应用此药治疗犊牛腹泻病，导致病原菌产生耐药性[7]。经过药物筛选，确定使用菌必治、阿米卡星两种抗生素，配合消毒、补液进行综合防治，80%病例治疗效果显著，20%病例症状明显缓和，病情基本稳定。引起犊牛腹泻的病因很多，包括消化不良、病毒、寄生虫或细菌感染等，在犊牛腹泻病的诊断、治疗和预防过程中也不能忽视这些因素的影响[8]。在临床上应该通过病原分离鉴定，结合流行病学调查分析确定腹泻病因，进一步提升犊牛自身抵抗力，做好环境卫生工作来预防本病。