环状RNA在畜禽中的研究进展

韩国超，马 峥，谭元生(佛山科学技术学院 生命科学与工程学院，广东 佛山 528000 )

1 circRNA的发现

1976年，sanger等[1]首次用电镜观察到植物类病毒颗粒中存有单链闭合环状RNA(circular RNA,circRNA)。1990年，Matsumoto等[2]在酿酒酵母中发现了环状 RNA的踪迹。此后，人们在小鼠中也发现存在SRY[3]与P4502C24等[4]circRNAs。由于技术的局限性及circRNA分子的特殊性，当时普遍认为circRNA是外显子错误剪切的产物，只是生命活动中的偶然事件，并未引起学术界重视。

近年来，随着科学技术的发展与在RNA领域的不断探索，研究者们发现生物体内普遍存在circRNA，circRNA逐渐被重视并开始了广泛地研究。2012年，Danan等[5]开发了环状RNA测序(circRNA-seq)技术，并将其应用于古细菌solfataricusP2中，发现circRNA在古生菌中大量存在且可能具有生物功能。同年，Salzman等[6]的研究结果表明，mRNA前体的反向剪接会形成多种环状RNA，这种现象在基因表达程序中普遍存在。2013年，Jeck等[7]通过测序发现，人成纤维细胞中存有25 000多种circRNA。此外，还发现一些circRNA比其母源linear RNA结构更稳定，表达更丰富。Memczak等[8]的研究表明circRNA可作为miRNA的sponge，从而参与转录后的调控。随着科学技术的发展，circRNA也逐步被人们所了解，但仍有很多未知的黑匣子等待被打开。

2 circRNA的形成

中心法则认为遗传信息首先从DNA传递给RNA(pre-mRNA)，再经过经典剪切形成传统的线性RNA。此过程中，经典剪切是指真核细胞的pre-mRNA在细胞核中经过去除内含子，连接外显子等剪接得到linear RNA的过程。区别于linear RNA的形成方式，反向剪接是形成circRNA的重要机制。在2013年，套索驱动环化和内含子配对驱动环化两种重要的circRNA形成机制被Jeck等[7]所提出。其中，套索驱动环化是指pre-mRNA在转录过程中发生外显子跳读，拉近两原本相离的外显子，然后下游外显子的3＇端通过共价键与上游外显子的5＇端发生结合，所形成的套索结构再经过inter-lariat 剪切得到circRNA。在内含子配套驱动环化中，pre-mRNA的两内含子通过配对原则结合，随后剪切配对的内含子，进而促进环状RNA分子的形成。

近年来，有研究表明，circRNA的形成还受RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBPs)的调控，RBPs可通过与内含子中的顺式原件结合，使得上下游外显子相互靠近，从而促进外显子环化[9]。另外，Zhang等[10]研究发现，位于内含子之间和内含子所含有的重复序列会对circRNA的形成数量与类型造成影响。套索驱动环化与内含子配对驱动环化的最大不同在于前者先外显子跳读，形成套索结构，最后通过反向剪切形成circRNA。后者是反向剪切后，直接生成circRNA。几种模型如图1所示。上述模型虽使得人们对circRNA的形成有更深入的理解，但尚需进一步试验验证。

图1 环状RNA形成模式图[11]A. 套索驱动环化；B. 内含子配对驱动环化；C. RBP调控circRNA生成Fig. 1 Models of circRNA biogenesis[11]A. Lariat-driven circularization; B. Intron pairing-driven circularization; C. circRNA biogenesis mediated by RBP

3 circRNA的特征

研究人员对circRNA的结构进行研究的同时，归纳总结出circRNA具有以下的特征：(1)大部分的circRNA是非编码RNA；(2)circRNA在不同生物体内不同类型组织和细胞中广泛且特异性表达；(3)大部分circRNA靠外显子反向剪切构成；(4)circRNA不存在5＇端和3＇端，是一种闭合的环状结构RNA，该结构使其对 RNase R不敏感[12]。用RNA外切酶 RNase R对RNA进行处理，可判断是否存在circRNA[13]；(5)circRNA的半衰期大多超过48 h[13]；(6)circRNA较其母源linear RNA更稳定，且表达丰度是其10倍以上[6-7]；(7)大多数circRNA具有高度保守的序列[6-7]；(8)绝大多数circRNA会富集在细胞质中，仅少数存在于细胞核[12]；(9)circRNA可充当miRNA的海绵体进而调节基因的表达[8]。上述的特征使circRNA成为了RNA领域的研究重点。

4 circRNA的功能

近年来，随着人们在circRNA领域不断探索，越来越多的circRNA被发现，circRNA在多个生命过程中扮演了重要的角色，其功能主要包括以下几个方面。

4.1 调控基因的转录

circRNA对基因的转录过程有调控作用。2013年，Zhang等[12]研究表明ci-ankrd52与PolII延伸有关，并充当后者转录的正向调节剂，敲除ciRNA会导致其自身基因的表达下调。此外，Li等[14]发现EliciRNA能与UsnRNP相互作用并且促进其亲本基因的转录。他们认为ElciRNA先与U1小分子核糖核蛋白体形成复合物，然后与RNAP II的转录产物结合并作用于亲本基因，最终调控亲本基因的表达。

4.2 与蛋白质相互作用

circRNA也可与蛋白相结合从而发挥作用。在果蝇与人类中，剪接因子MBL的第二外显子进行内含子间的相互配对，驱动自身环化成circMBl，然后再识别并结合MBl蛋白。当细胞内MBl蛋白水平过高时，会促进其自身外显子形成circMBl，继而circMBl与MB1蛋白相互结合，使MB1蛋白含量降低[15]。另外，ID-1、E2F1、FAK和HID1a会被circ-Foxo3识别、结合并滞留在细胞质中，使其抗衰老和抗应激作用受到抑制，最终加快细胞衰老的进程[16]。

4.3 作为miRNA sponge

ceRNA假说认为ceRNA可与miRNA结合，竞争性地抑制miRNA与mRNA结合，进而调控基因的表达[17-19]。近期的研究表明，circRNA 中含有大量能与miRNA结合的应答原件，从而降低miRNA对靶基因的抑制作用。例如CDR1as(antisense to the cerebellar degeneration-related protein 1 transcript)就可作为miR-7 sponge。CDR1as是长约1.5 kb，含74个miR-7应答原件的circRNA。主要在人和鼠的脑中表达。它对miR-7起负调控的作用。即当CDR1as表达量增加时，更多的miR-7被CDR1as结合，使得miR-7的含量降低，进而间接调节miR-7靶基因的表达量[20]。此外，Memczak等[8]研究发现，胚胎斑马鱼的中脑体积与CDR1as之间存有较强的负相关。Hansen等[21]通过荧光素酶基因报告试验推断出由SRY基因转录而来的SRYcircRNA可充当miR-138的“sponge”，通过MRE与后者结合，从而抑制后者的活性。Wang等[22]研究发现心脏环状RNA(HRCR)可作为miR-223的海绵，调节并控制ARC(miR-223的下游靶点)的表达，进而抑制心肌的肥厚与衰竭。如今，越来越多的circRNA被发现可充当miRNA 的sponge，但得到验证的相对较少，这也表明此方面还需进一步的研究。

5 circRNA在畜禽中的相关研究

畜禽的经济性状和疾病防控始终受到人们的关注。随着在circRNA领域进一步的探索与研究，人们发现其在畜禽肌肉生长发育、生产性能和疾病等方面都扮演着重要的角色。

5.1 生长发育方面

环状RNA在畜禽生长发育中起着重要的作用。Liang等[23]对贵州小型猪的骨骼肌进行RNA-seq，确定了149个与肌肉生长发育有关的circRNAs。其中SSC-CIR-02753、SSC-CIR-04353、SSC-CIR-04335和SSC-CIR-04349等通过调控肌细胞的增殖来调节肌肉的生长发育。此外，推测SSC-CIR-01595、SSC-CIR-01592和SSC-CIR-03395等可能参与骨骼肌收缩过程[23]。Chen等[24]通过对雅南母猪的背最长肌进行RNA-seq，发现在骨骼肌老化的过程中，circRNA 014844、circRNA 011308和circRNA 018401与miR-493-5p呈正相关，与肌肉萎缩相关基因FGB负相关。推测以上circRNAs可能参与肌肉衰老过程的调节。Li等[25]采集胚胎期和成年期哈萨克羊的背部最长肌组织，对circRNA进行功能分析发现，circRNA 0000385、circRNA 0000582和circRNA 0001099等含有多个与肌肉发育相关的miRNA的MREs。Wei等[26]研究表明，CircLMO7可促进牛成肌细胞增殖，但会抑制其分化。在牛肌肉的发育过程中，过表达的CircLMO7可通过MRE与miR-378-3p结合，从而影响骨骼肌的发育。Ouyang等[27]对11胚龄、16胚龄、1日龄的杏花鸡的腿肌进行RNA-seq，发现circRBFOX2可与miR-206相结合，从而促进肌细胞增殖。同时还发现，circSVIL在鸡胚发育后期高度表达，其可充当miR-203的sponge来促进成肌细胞的增殖和分化[28]。在鸡胚骨骼肌发育过程中，研究发现FGFR2基因外显子3～6环化形成的circFGFR2可通过吸附miR-133a-5b和miR-29b-1-5p间接调控骨骼肌细胞的增殖分化[29]。此外，circZBTB10在鸡的肌肉组织中高表达，过表达circZBTB10可促使肌细胞大量增殖，影响骨骼肌的发育[30]。

5.2 生产繁殖方面

环状RNA在畜禽生产繁殖过程中起着重要的作用。Zhang等[31]对产后90 d和250 d的奶牛乳腺组织进行RNA-seq，发现大量差异表达circRNAs。功能富集分析表明，与250 d奶牛乳腺组织相比，90 d中来源于酪蛋白的circRNA高表达，且具有miR-2284的MRE。这表明它可能与酪蛋白的表达调控有关。Song等[32]采集妊娠后5 d和15 d的山羊子宫内膜，通过illumina Solexa测序发现circRNA的表达具有阶段特异性。进一步分析发现，来源于CRIM1的circRNA8073通过结合miR-449a的靶位点抑制miR-449a的活性，进而影响山羊的怀孕。此外，Zhang等[33]应用RNA测序技术从绵羊的下丘脑中共鉴定出41 863个circRNAs，差异表达的有340个circRNAs。通过功能富集分析，推测oar-circ-0018794、oar-circ-0008291、oar-circ 0013788等可直接或间接调控促性腺激素释放激素，进而影响绵羊的生殖过程。Shen等[34]以京海黄鸡小黄卵泡颗粒细胞和膜细胞为研究对象，推测来源于IGFIR基因和TOX2基因的circRNAs在等级前卵泡时期可与miRNA相互作用，共同调控mRNA的转录与表达，影响卵泡的发育，进而影响鸡的产蛋性能。

5.3 疾病研究方面

环状RNA在畜禽疾病调控中扮演了重要的角色。Yan等[35]以感染了C型产气荚膜梭菌的7 d仔猪为研究对象，通过KEGG等分析发现circ -0002287的母基因主要富集在病毒致癌和转化生长因子b信号通路上，推测circ -0002287通过与miR378结合，在产气荚膜梭菌的感染过程中发挥海绵体的作用。Zhao等[36]研究发现，circEZH2可通过海绵吸附miR-22，抑制猪传染性胃肠炎病毒诱导的线粒体通透性转换孔开放，从而降低炎症的发生。Zhang等[37]用鸡禽白血病J(ALV-J)亚型侵染 ALV 抗性和 ALV 敏感性鸡，对肝组织进行测序，发现了12个与免疫相关的circRNAs。目前，circRNA在动物畜禽疾病方面的研究还较少，且主要集中在人类疾病领域，相信随着研究的不断深入，更多与疾病相关的circRNA在动物中将被发现，为动物疾病防控、抗病育种等提供科学指导。

6 展 望

随着科学技术的发展，circRNA的研究越来越多，circRNA的结构与功能也逐渐被揭示。但circRNA在畜禽方面的研究还较少，大多数关于circRNA的研究还停留在初期，即发现并预测circRNA的功能。少数研究者做了其功能的深入验证，相信随着生物技术的迭代更新及大量科学研究在畜禽circRNA领域的聚焦，circRNA在畜禽领域的潘多拉魔盒将会逐渐打开，这将为畜禽分子育种及疾病防控提供有力科学依据，为畜牧业的发展提供科学基础。