29株淡水真菌固体发酵提取物的抑菌活性研究

李永建，韦明杰，张 凰

(昆明理工大学 农业与食品学院，云南 昆明 650500)

0 引 言

近年来，真菌的次级代谢产物因结构出新率高、生物活性显著，是新药物开发的重要来源，已成为药物化学领域的研究热点[1].淡水真菌是真菌的一个重要类群，其生存环境与海洋真菌和土壤真菌的巨大差异，导致淡水真菌次级代谢产物的化学多样性明显不同于这两类真菌.董锦艳等人[2]综述了淡水真菌代谢产物的研究进展，发现其代谢物化学结构类型复杂多样，多数具有抗肿瘤、抗细菌、抗真菌、抗虫等生物活性，在医药与农药研发等领域有着广阔的应用前景.这些具有重要意义的生物活性物质多来自淡水真菌的固体发酵产物.由于很多抗生素来源于具有较好抑菌活性的发酵产物，所以对淡水真菌发酵产物的生物活性研究首选抑菌活性研究.

随着真菌分类学的发展，越来越多的淡水真菌被发现和报道，为我们研究淡水真菌的发酵产物的活性提供了更多的材料[3-6].由于很多抗生素来源于具有较好抑菌活性的真菌发酵产物，所以对淡水真菌的次级代谢产物生物活性的研究首选抑菌活性研究.Fisher和Anson[7]在1983年首次报道了淡水真菌的抑菌活性，文章中指出淡水真菌Massarinaaquatica可以抑制蜡状芽孢杆菌和腐生葡萄球菌等.随后，Fisher等人[8]报道淡水真菌Helicoonrichonis可以抑制蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌等.近年来，关于淡水真菌抑菌活性的报道逐渐增加.Lindgomycesmadisonensis被报道可以抑制耻垢分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌[9]；Tricladiumcastaneicola可以抑制病原真菌Phytophthoracapsici[10]；Ophiocerasleptosporum可以抑制蜡状芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌[11].由于同一目(order)真菌的亲缘关系相近，所以发酵产物的活性也有相似之处，因此以目为单位研究淡水真菌的抑菌活性是必要的.统计发现已报道的具有抑菌活性的淡水真菌共102株(含7株未确定分类地位的淡水真菌)，分布在8个纲(class)22个目中(表1).其中Pleosporales目数量最多，为28株，其次是Eurotiales目14株，Orbiliales目10株.抑活淡水真菌比例最高的目为Magnaporthales，占50%.

表1 已报道的具有抑菌活性淡水真菌在各目中的数量

为了增加对淡水真菌抑菌活性的认识，也为了研究抑活淡水真菌在不同目的分布规律，本研究对隶属于13个目的29株淡水真菌进行固态发酵，对发酵产物进行抑菌活性筛选，并结合已报道的分布情况，总结了不同目淡水真菌的抑菌活性规律，为后期筛选淡水真菌的抑菌活性提供依据，以提高筛选效率.

1 实验材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验用淡水真菌菌株

实验选用了29株从泰国清迈和清莱等地区采集到的淡水腐木真菌的纯培养物，详见表2.

表2 29株淡水真菌列表

1.1.2 供试病原菌

实验选用的6种食源性病原细菌分别为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis(ATCC6633)、李斯特菌Listeriamonocytogenes(ATCC19115)、志贺菌Shigellasp.(CMCC51105)、沙门氏菌Salmonellasp.(CMCC50093)、大肠杆菌Escherichiacoli(ATCC25922)和金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus(ATCC29213).选用的3株植物病原真菌分别为灰葡萄孢菌Botrytiscinerea、水稻枯纹菌Rhizoctoniasolani和尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum.

1.2 实验方法

1.2.1 真菌发酵和产物提取

真菌发酵和产物提取是在Ayers和Reyes-Estebanez发酵和提取的方法基础上进行改进[14-15].具体为将淡水真菌菌株接种在PDA培养基表面，在27℃下培养到菌落直径3～5 cm.在超净工作台中用无菌吸管将菌落分割成直径0.5 cm、大小均匀的圆形菌落.取10～15个菌落置于灭菌后的100 mL PDB液体培养基中，封口后放于恒温摇床中以180 r/min、28℃振荡培养至发酵液粘稠(不同真菌的发酵速度不同，约为5～15 d).在250 mL三角瓶中加入40 g大米和等体积珍珠岩，以及60 mL蒸馏水，封口后浸泡1 d，121℃灭菌20 min.将5 mL发酵液加入大米培养基中，封口后，先在恒温摇床中180 r/min、28℃培养6 d，再取出于28℃恒温静置培养，直到菌体布满所有大米.

在发酵后的固态培养基中加入100 mL乙酸乙酯浸提，超声30 min停1 h，超声三次后静置，直至乙酸乙酯层澄清，过滤得到乙酸乙酯层，每瓶固态发酵产物用乙酸乙酯重复浸提3次.将三次浸提液混合后用无水硫酸钠除去浸提液中的少量水分，将浸提液真空浓缩干燥(水浴温度≤40℃).称取干燥后的提取物10 mg，用二甲基亚砜溶解，配制成浓度为10 mg/mL的发酵液备用.

1.2.2 抑菌活性筛选

根据郑毅等人[1,20]的实验方法，用牛津杯法进行病原细菌的抑制实验，用滤纸片法进行病原真菌的抑菌实验.牛津杯法：用生理盐水将在LB液体培养基中活化的病原细菌稀释成浓度为(0.8～2)×105cfu/mL的菌悬液.吸取80 μL的病原细菌菌液均匀涂布在LB琼脂平板上.在每个平板上放置3个牛津杯，每个牛津杯中加入10 μL的发酵液，37℃培养18～24 h后用游标卡尺测量抑菌圈直径.滤纸片法：取直径为6 mm的滤纸片，浸泡在浓度为10 mg/mL的发酵液中(每片滤纸片承载的样品量大约为10 μg).将风干后的滤纸片放在接种了病原真菌的PDA平板上，培养3～4 d，观察是否出现抑菌圈.

2 结果与讨论

2.1 对病原细菌的抑制效果

淡水真菌固态发酵提取物抑制病原细菌的结果见表3.29株淡水真菌至少对2种病原细菌具有抑制作用，其中6株对全部6种供试病原细菌均具有抑制作用(图1)，占比20.7%，它们为ClohesyomycesaquaticusMFLUCC 15-0979(Pleosporales目)、DictyochaetaaquaticaMFLUCC 15-0983(Chaetosphaeriales目)、DictyosporellathailandensisMFLUCC 15-0985(Sordariomycetes中不确定目)、DistoseptisporatectonaeMFLUCC 15-0981(Distoseptisporales目)、PseudoproboscisporathailandensisMFLUCC 15-0989(Annulatascales目)和Tubeufiasp. MFLUCC 15-0998(Tubeufiales目).其中，Tubeufiasp. MFLUCC 15-0998抑菌活性最强，对4种病原细菌抑菌圈直径均大于12.00 mm.能够抑制5种病原细菌的淡水真菌为11株，能够抑制4种和3种病原细菌的均为5株，剩余2株只能抑制2种病原细菌.

表3 29株淡水真菌固态发酵提取物对病原细菌的抑制效果

图1 6株淡水真菌的抑菌效果图

在革兰氏阳性菌中，对全部3种供试病原菌均表现出抑制活性的淡水真菌共14株，占比48.3%，抑菌圈平均直径分布在9.75～13.8 mm.李斯特菌被抑制的概率最高，共23株，占比79.3%，隶属于10个目.其中DictyochaetaaquaticaMFLUCC 15-0983的抑菌效果最好，抑菌圈平均直径为12.38 mm.22株淡水真菌能抑制金黄色葡萄球菌，占比75.9%，隶属于12个目.其中Strain MFLUCC 15-0988的抑菌效果最好，抑菌圈平均直径为13 mm.Chaetothyriales、Distoseptisporales、Savoryellales和Sporidesmiales 4个目对金黄色葡萄球菌抑菌活性是首次报道.21株淡水真菌能抑制枯草芽孢杆菌，占比72.4%，隶属于9个目.其中DictyosporellathailandensisMFLUCC 15-0985的抑菌效果最好，抑菌圈平均直径为13.8mm.本研究首次揭示了Chaetothyriales、Distoseptisporales、Jahnulales、Magnaporthales和Sporidesmiales 5个目对枯草芽孢杆菌的抑菌活性，但未观察到Pleurotheciales目的3株淡水真菌对枯草芽孢杆菌的抑菌活性，此前也没有Pleurotheciales目淡水真菌抑制枯草芽孢杆菌的报道.

在革兰氏阴性菌中，对全部3种供试病原菌均表现出抑制活性的淡水真菌共10株，占比34.5%，抑菌圈平均直径分布在10.34～13.98 mm.志贺菌被抑制的概率最高，共24株，占比82.6%，隶属于11个目.其中DictyochaetathailandensisMFLUCC 15-0985的抑菌活性最强，抑菌圈平均直径为13.98 mm.前人研究中只报道了一株Tubeufiales目淡水真菌Helicosporiumsp.可以抑制志贺菌[21]，而本研究首次揭示了Annulatascales、Atractosporales、Chaetosphaeriales、Chaetothyriales、Distoseptisporales、Hypocreales、Jahnulales、Pleosporales、Pleurotheciales和Sporidesmiales 10个目对志贺菌的抑菌活性.20株淡水真菌能抑制大肠杆菌，占比69%，隶属于11个目.其中Tubeufiasp. MFLUCC 15-0998的效果最好，抑菌圈平均直径为13.03 mm.本研究首次揭示了Annulatascales、Atractosporales、Distoseptisporales和Tubeufiales 4个目对大肠杆菌的抑菌活性.20株淡水真菌能抑制沙门氏菌，占比69%，隶属于9个目.其中Pleurotheciaceaesp.2. MFLUCC 15-0994的抑菌效果最好，抑菌圈平均直径为13.42 mm.Monkai等人[11]和Choi等人[21]也选用了沙门氏菌做淡水真菌抑菌活性实验，结果均未显示出对沙门氏菌的抑菌活性.而本研究中首次观察到9个目淡水真菌对沙门氏菌具有抑菌活性，分别为Annulatascales、Chaetosphaeriales、Distoseptisporales、Hypocreales、Jahnulales、Pleosporales、Pleurotheciales、Savoryellales和Tubeufiales.

2.2 对病原真菌的抑制效果

29株淡水真菌固态发酵提取物抑制病原真菌结果见表4，效果图见图2.共有17株淡水真菌对至少1种供试植物病原真菌表现出抑菌活性，占筛选淡水真菌总数的58.6%.仅有PseudoasteromassariaspadiceaMFLUCC 15-0973对3种供试植物病原真菌均表现出较强的抑菌活性.抑制2种病原真菌的淡水真菌为3株，其中DictyosporellathailandensisMFLUCC 15-0985和Longipedicellatasp. MFLUCC 15-0965都对水稻枯纹菌具有较强的抑制效果.抑制1种病原真菌的淡水真菌为13株.在这3种病原真菌中，尖孢镰刀菌被抑制的概率最高，共8株，占比27.6%，隶属于Pleosporales、Pleurotheciales和Tubeufiales.在前人研究中，有41.2%的测试菌株能抑制尖孢镰刀菌，效果比较好的为Aspergillus(Eurotiale目)和Chloridiumsp.(Chaetosphaeriales目)[22-24].7株淡水真菌能抑制灰葡萄孢菌，占比24.1%，隶属于Annulatascales目、Atractosporales目、Chaetothyriales目、Hypocreales目、Jahnulales目和Pleosporales目.在前人的研究中，有50%的测试菌株能抑制灰葡萄孢菌，分别为Massarina和Pithomyces(Pleosporales目)、Cladosporium(Capnodiales目)、Aspergillus、Paecilomyces和Penicillium(Eurotiales目)、Papulaspora(Coronophorales目)、Cephalosporium(Hypocreales目)、Trichaegum(Ascomycota不确定目)[7，22-23].由此可见，Hypocreales目和Pleosporales目真菌抑制灰葡萄孢菌的概率较大.抑制水稻枯纹菌的7株淡水真菌分别隶属于Pleosporales目、Savoryellales目和Tubeufiales目.在前人的研究中，只有23.6%的测试菌株对其具有抑菌活性，效果比较好的为Chloridiumsp.(Chaetosphaeriales目)、Delitschiacorticola和Massarinabipolaris(Pleosporales目)、Monacrosporiumellipsosporum(Orbiliales目)和Tiarosporellapaludosa(Botryosphaeriales目)[7,22,25-26].所以，Pleosporales目的真菌能够抑制水稻枯纹菌的概率较大.

表4 29株淡水真菌固态发酵提取物对病原真菌的抑制效果

图2 淡水真菌对病原真菌较为显著的抑菌效果图

本研究所测试的29株淡水真菌中，16株隶属于粪壳菌纲(Sordariomycetes)，11株隶属于座囊菌纲(Dothideomycetes)，1株隶属于散囊菌纲(Eurotiomycetes)，1个为未鉴定菌株(表2).结合已有报道，具有抑菌活性的淡水真菌在不同目的分布见图3.从图中可以看出，本研究首次报道了4个目的淡水真菌的抑菌活性，分别为Atractosporales、Distoseptisporales和Sporidesmiales，隶属于粪壳菌纲，以及Chaetothyriales，隶属于散囊菌纲.总体上看，47株隶属于座囊菌纲，18株隶属于散囊菌纲，40株隶属于粪壳纲.具有抑菌活性淡水真菌最多的目为Pleosporales，共32株，其次为Eurotiales目14株，Magnaporthales目10株.Pleosporales目抑活淡水真菌较多与其淡水真菌总量较大有关.Pleosporales目淡水真菌总数为215株[12]，具有抑菌活性淡水真菌仅占14.88%.Magnaporthales目淡水真菌总数为18株[13]，具有抑菌活性的淡水真菌占55.56%.

图3 具有抑菌活性(抑制病原细菌或真菌)的淡水真菌在座囊菌纲(1～5)、散囊菌纲(6～8)和粪壳菌纲(9～22)不同目的分布(柱状图上的数字来自本研究结果)

3 结 论

本研究中13个目(29株)淡水真菌都具有抑菌活性，至少可以抑制食源性病原细菌枯草芽孢杆菌、李斯特菌、志贺菌、沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中的2种.其中有6株淡水真菌对6种病原细菌都具有抑制活性，它们分别隶属于Annulatascales目、Chaetosphaeriales目、Distoseptisporales目、Pleosporales目和Tubeufiales目.只有9个目(17株)淡水真菌可以抑制植物病原真菌.具有抑制活性的淡水真菌数量最多的3个目分别为Tubeufiales目、Pleosporales目和Pleurotheciales目.本研究的主要结论和贡献如下：

1)首次报道了Atractosporales目、Chaetothyriales目、Distoseptisporales目和Sporidesmiales目淡水真菌的抑菌活性.

2)针对革兰氏阳性菌，首次报道了4个目(Chaetothyriales、Distoseptisporales、Savoryellales和Sporidesmiales)淡水真菌对金黄色葡萄球菌的抑菌活性；5个目(Chaetothyriales、Distoseptisporales、Jahnulales、Magnaporthales和Sporidesmiales)淡水真菌对枯草芽孢杆菌的抑制活性.

3)针对革兰氏阴性菌，首次报道了11个目(Annulatascales、Atractosporales、Chaetosphaeriales、Chaetothyriales、Distoseptisporales、Hypocreales、Jahnulales、Pleosporales、Pleurotheciales、Sporidesmiales和Tubeufiales)淡水真菌对志贺菌的抑制活性，4个目(Annulatascales、Atractosporales、Distoseptisporales和Tubeufiales)淡水真菌对大肠杆菌的抑制活性，9个目(Annulatascales、Chaetosphaeriales、Distoseptisporales、Hypocreales、Jahnulales、Pleosporales、Pleurotheciales、Savoryellales和Tubeufiales)淡水真菌对沙门氏菌的抑制活性.

4)针对植物病原真菌，首次报道了3个目(Pleosporales、Pleurotheciales和Tubeufiales)淡水真菌对尖孢镰刀菌的抑制活性，4个目(Annulatascales、Atractosporales、Chaetothyriales和Jahnulales)淡水真菌对灰葡萄孢菌的抑制活性，2个目(Savoryellales和Tubeufiales)淡水真菌对水稻枯纹菌的抑制活性.

结合本研究结果和已报道的淡水真菌抑菌活性可以看出，具有抑菌活性的淡水真菌主要分布在Pleosporales目、Eurotiales目和Magnaporthales目.但是目前所测试的淡水真菌的样本量还不够多，今后随着淡水真菌的不断报道，以及测试样品量的不断增大，这一结论可能会被质疑.本研究在现有的基础上，不仅为淡水真菌的抑菌活性研究补充了可靠数据，丰富了淡水真菌抑菌活性的分布，也初步总结了具有抑菌活性的淡水真菌在不同菌目的大致分布和抑菌规律，增加了对淡水真菌的认识，对淡水真菌研究具有重要意义.