黑骨藤LC-MS定性分析及4种绿原酸一测多评分析方法

李 琪， 王 博， 李晨阳， 赵喜玲， 陈 坤， 张 宏*

（1.四川师范大学 生命科学学院，四川 成都610101； 2.四川师范大学 植物资源应用与开发研究所，四川 成都610101）

黑骨藤（Periploca forrestiiSchltr.）为萝藦科（Asclepiadaceae）杠柳属（Periploca Linn）植物，又名黑龙骨（HLG），曾用于治疗类风湿性关节炎和一些创伤［1］.现代药理实验证明，黑骨藤具有抗氧化［2］、抗炎［3］、抗癌［4］、神经保护［5］等作用.然而，黑骨藤的化学成分复杂，各种化学成分的极性差异很大，这使得很难对其进行定性研究.目前，黑骨藤化学成分相关研究报道较多，成分包含挥发油、皂苷、杠柳苷等多种类型化合物，并已建立了HPLCQ-TOF-MS对其进行定量测定［6-7］.近年来，一种新的、简单快速的技术——UPLC-Q-TOF-MS得到了广泛应用，它可提供关于特征分子离子和碎片离子的准确的质量信息，在代谢物的鉴定和结构解析中起着重要的作用［8-9］.因此，本研究采用UPLC-QTOF-MS技术.

外标法是最常用的评价方法之一，由于一些对照品具有高成本、化学多样性和检测的不稳定性等因素，使其具有局限性［10-11］.为了解决这一问题，王智民等［12］首次系统地提出了一测多评法（QAMS）.中国药典（2015版）已报道此法适用于中药材的含量测定［13］，其优点是每种分析物的含量可以独立测定，并且可以减少实验成本和检测时间［14-15］.基于目前关于黑骨藤QAMS法的缺乏，本文采用了QAMS法，以隐绿原酸为内标物，分别计算其与绿原酸、异绿原酸C、新绿原酸的相对校正因子（RCF）而得出其含量，从而建立黑骨藤中4种绿原酸的一测多评分析方法，为黑骨藤的质量评价提供了一种快速、实用、有效的方法.

1 材料、试剂与方法

甲醇、乙醇（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）；乙腈（色谱纯，美国天地试剂公司）；磷酸、甲酸、醋酸（色谱纯，成都市科龙化工试剂厂）；硅胶（200～300目，青岛海浪硅胶干燥剂厂）.绿原酸、新绿原酸（成都瑞恩思生物科技有限公司），隐绿原酸、杠柳毒苷、原花青素A1、原花青素A2、异绿原酸C（深圳市斯坦德合成有限公司）.所有对照品经UPLC峰面积归一化法检测质量分数均大于98%.

1.3 色谱条件

1.3.1 UPLC-Q-TOF-MS色谱条件 色谱柱：Eclipse Plus-C18（100 mm×4.6 mm，1.8μm）.流速：0.7 mL/min.柱温：30℃.进样量：5μL.检测波长：221 nm.流动相：流动相A（体积分数为0.1%的甲酸溶液）；流动相B（体积分数为0.1%的甲酸乙腈）.梯度洗脱程序：0～8.0 min，95%～85%A；8.0～12.0 min，85%～82%A；12.0～20.0 min，82%A；20.0～25.0 min，82%～80%A；25.0～40.0 min，80%～70%A；40.0～60.0 min，70%～5%A.质谱条件：正负离子扫描模式.扫描范围（m/z）：100～1 500.雾化气（GS1）：50 psi.雾化气（GS2）：50 psi.气帘气（CUR）：30 psi.离子源温度（TEM）：-550℃，600℃.离子源电压（IS）：-4 500 V、5 500 V.一级扫描：去簇电压（100 V）；聚焦电压（10 V）.二级扫描：采用IDA模式，CID能量为20、40和60 V.

1.3.2 QAMS法色谱条件 色谱柱：ZORAX SB C18（2.1 mm×100 mm，1.8μm）.流速：0.3 mL/min.柱温：40℃.检测波长：325 nm.进样量：1μL.流动相A：甲醇；流动相B：体积分数为0.1%的磷酸水溶液（pH=3.0）.梯度洗脱程序：0～10.0 min，5%～25%A；10.0～25.0 min，25%～40%A；25.0～30.0 min，40%～60%A.

1.4 混合对照品溶液的制备 称取新绿原酸（6.70 mg）、绿原酸（7.54 mg）、隐绿原酸（4.71 mg）和异绿原酸C（4.84 mg）、原花色素A1（4.25 mg）、原花色素A2（4.39 mg）和杠柳毒苷（4.48 mg）于10 mL容量瓶中，色谱甲醇溶解定容到刻度以制备混合标准溶液，再经0.22μm滤膜过滤后待用.

1.5 供试品溶液制备 称取已活化的硅胶200 g于1 L烧杯中，采用湿法装柱，加入600 mL石油醚搅拌均匀装柱.粉碎黑骨藤样品，过3号药典筛.称取50 g干粉于1 L锥形瓶中，按料液比1∶20，加入体积分数为50%的乙醇1 L，超声（功率200 W，频率40 kHz）提取30 min，提取温度50℃，提取2次.将2次提取液合并减压浓缩旋干至干粉.取5 g干粉于50 mL烧杯中，添加10 g硅胶，加入40 mL甲醇，于通风橱中待自然风干成细粉末后上样.依次用石油醚、V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）=1∶1、乙酸乙酯、V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）=1∶1、甲醇洗脱，最终收集乙酸乙酯片段和V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）=1∶1片段.称取上述2个片段各10 mg加入5 mL甲醇于离心管中，超声处理（功率200 W，频率40 kHz）30 min，离心10 min（12 000 RPM，4℃）.取上层清液转移到1.5 mL离心管中，200μL体积分数为50%的甲醇溶液溶解，经0.22μm微孔膜过滤后，供UPLC-Q-TOF-MS分析.

在QAMS方法建立中，将S1样品收集粉碎，过3号药典筛.称取1 g左右的干粉于50 mL锥形瓶中，按料液比1∶20，加入体积分数为50%的乙醇20 mL，超声提取30 min（功率200 W，频率40 kHz），提取温度50℃，提取1次，抽滤、减压浓缩旋至近干，色谱甲醇洗3次转移到5 mL容量瓶中，定容得黑骨藤供试品溶液.

从图2可看出，谷索的就位对吊索索力影响很小；脊索就位对不同索的索力影响不同；膜的安装将提高吊索的索力。

1.6 QAMS方法学考察

1.6.1 标准曲线及检测限、定量限 精密移取混合对照品溶液各0.3、0.5、0.8、1.0、2.0、4.0 mL，分别用色谱甲醇定容于10 mL容量瓶中.每个浓度平行测定3次，记录混合对照品的峰面积，以峰面积为纵坐标，溶液质量浓度为横坐标，建立隐绿原酸、异绿原酸C、新绿原酸、绿原酸的标准曲线，得线性方程、线性范围、相关系数.选取最低浓度对照品，采用逐级稀释方法，每次稀释2倍，按照色谱条件进行检测.借助信噪比，以S/N=3为检测限，以S/N=10为定量限.

1.6.2 精密度、重复性、稳定性和加标回收率 平行测定混合标准溶液和S1供试品溶液6次，以考察仪器精密度和样品精密度.选取6份1.000 g的S1号黑骨藤样品考察重复性，并在0、2、4、6、8、10、12、24和48 h对供试品溶液进行测定，以获得其稳定性.选取3份5.000 g的S1号黑骨藤样品，每份按药材与对照品质量比约1∶1的量加入对照品，根据（1）式［16］计算每种分析物的加标回收率.精密度、重复性、稳定性和加标回收率的相对标准偏差均用RSD表示.

1.7 RCF的测定及评价精密移取混合对照品溶液各0.3、0.5、0.8、1.0、2.0、4.0 mL，色谱甲醇定容于5 mL容量瓶，色谱甲醇定容至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜.由于在一定的线性范围内，组分的浓度与检测器的响应成正比［10］，本次实验以隐绿原酸为内参物，对每个浓度平行测定3次，分别运用（2）式［11］计算隐绿原酸相对于其他组分的相对校正因子（RCF），用f表示，并计算其相对标准偏差RSD.As为内参物峰面积，Ws为内参物质量，Ai为其他组分的峰面积，Wi为其他组分的质量.

分析物的浓度是影响RCF的主要参数之一，但RCF还受其他实验条件的影响［11］.本次实验考察了不同色谱柱及其温度和不同进样量对RCF的影响以验证其稳定性.

1.8 待测成分色谱峰的定位待测成分色谱峰的准确定位是建立QAMS的前提和关键，主要有2种主要的峰定位方法，保留时间RT（retention time）和待测成分与内标物之间的相对保留时间RRT（relative retention time）［15］.本实验以隐绿原酸与其他3种组分的相对保留时间值对黑骨藤中待测成分色谱峰进行定位.

1.9 外标法与一测多评法的比较分别用外标法和一测多评法计算S1～S8不同产地黑骨藤中隐绿原酸、异绿原酸C、新绿原酸、绿原酸的含量，基于t检验、相关系数R［17］、相对标准偏差RSD［18］和相对误差δ［19］，验证一测多评法与外标法是否存在差异性.

2 结果

2.1 UPLC-Q-TOF-MS结果各洗脱片段UPLC分析结果如图1所示.

图1 硅胶柱层析洗脱色谱图Fig.1 Chromatogram of silica gel column chromatography elution

分析可知：石油醚片段和甲醇片段含有少量的峰，而在其他2个片段中含有大量的峰，且其中有的峰与石油醚片段和甲醇片段中的有所重复，表明大多数组分存在于乙酸乙酯片段和V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）=1∶1片段中，故最终选择上述2个片段用于定性分析，它们的总离子流色谱图如图2所示，具体参数见表2.通过比较分子式、保留时间tR、准分子离子和产物离子，质量误差均在8.6×10-6以内，共分离鉴定出10种化合物.

图2 黑骨藤提取物总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatograms of the extracts from HLG

表2 黑骨藤提取物中被鉴定出的10种成分Tab.2 Identification of 10 components in HLG extracts

2.2 方法学考察结果回归分析的结果见表3，相关系数R≥0.999 5，表明所有组分均表现出良好的线性，回归方程可用于给定浓度范围内的定量分析.由表4可得RSD值均小于2.0%，表明本方法具有良好的准确性和重现性，稳定可行.

表3 4种绿原酸的线性关系Tab.3 Linear relationship of 4 chlorogenic acids

表4 精密度、重复性、稳定性和加标回收率结果（n＝6）Tab.4 Results of precision，stability，repeatability and recovery（n＝6）

2.3 RCF的测定及评价结果如表5所示，f1（隐绿原酸/异绿原酸C）、f2（隐绿原酸/新绿原酸）、f3（隐绿原酸/绿原酸）的RSD值分别为1.71%、1.41%、1.17%，均小于2%，说明3者的RCF都符合定量要求，以隐绿原酸为内标物来计算其余3种化合物含量的方法是切实可行的.在表6～8中的RSD值均小于2%，说明已测定的RCF值在不同的色谱柱、柱温和进样量的条件下均具有良好的稳定性.

表5 相对校正因子计算结果Tab.5 Calculation results of RCFs

表6 不同柱温时的相对校正因子结果Tab.6 RCFs based on different column temperatures

表7 不同进样量时的相对校正因子结果Tab.7 RCFs based on different injection volumes

表8 不同色谱柱时的相对校正因子结果Tab.8 RCFs based on different columns

2.4 待测成分色谱峰的定位结果如图3所示，待分析物于23 min内实现了良好的分离.异绿原酸C、新绿原酸、绿原酸的相对保留时间分别为2.015、0.626和0.908 min，其RSD值分别为1.98%、1.72%和1.85%，均小于5%，表明峰的识别结果可靠，可用于色谱峰的定位.

图3 UPLC色谱图Fig.3 Chromatograms of the sample

2.5 外标法与一测多评法的比较结果分别以一测多评法和外标法测定S1～S8样品中异绿原酸C、新绿原酸、绿原酸的含量.结果如表9所示，P值分别为0.956、0.983、0.995，均大于0.05，相关系数R均大于0.999 3，同时相对误差δ和相对标准偏差RSD值均小于5%.表明一测多评法与外标法无显著差异，说明将一测多评法应用于黑骨藤中4种绿原酸含量测定研究基本可行.

表9 外标法与一测多评法的比较结果Tab.9 Comparison of External Standard Method and QAMS

3 讨论

3.1 硅胶柱层析洗脱体系的选择由于黑骨藤中化学成分极性差距较大，为使大部分成分均能被分离出来，故本实验选取石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱体系.极性小的石油醚先除去黑骨藤中的色素、油脂等成分，再利用乙酸乙酯将中等极性成分洗脱出来，再利用V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）=1∶1将极性大的部分洗脱出来，最后利用甲醇将硅胶柱洗脱干净，分离出不同极性片段.

3.2 一测多评法色谱条件的确定考察了流动相体系（乙腈-水、甲醇-水、乙腈-醋酸、甲醇-醋酸、乙腈-磷酸、甲醇-磷酸、乙腈-甲酸、甲醇-甲酸）和流动相pH（2.5、3、3.5、4.0），实验结果表明：当流动相为甲醇-甲酸体系且pH=3时，被检测物质峰形尖锐，无拖尾现象，且分离度都在1.5以上.运用Aglient 1290 DAD二极管阵列检测器，对隐绿原酸、异绿原酸C、新绿原酸、绿原酸进行190～400 nm全波长扫描，最大紫外吸收波长为325 nm，且分离度均大于1.5，故选择325 nm为检测波长.在这些条件下，4种绿原酸都能被较好地检测到，保障测定结果的准确性.

3.3 一测多评法内标物的确定异绿原酸C、新绿原酸和绿原酸均曾被选为内标物，然而其他3种化合物的RCF值与其RSD值的结果表明：只有当隐绿原酸作为内标物时，其他分析物RCF的RSD值才均小于2%.因此，本实验选择隐绿原酸作为内标物，利用它对另外3种成分进行定量，从而建立黑骨藤中4种绿原酸的一测多评法.

4 结论

本实验运用UPLC-Q-TOF-MS联用技术从黑骨藤提取物中共分离并鉴定出10种化合物，其中，杠柳毒 苷、periplogenin 3-O-β-D-glucopyranosyl-（1→4）-O-β-D-digitoxopyranoside和periplocymarin能诱导皮肤成纤维细胞合成胶原，与伤口愈合有关［20］.新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸能治疗免疫性关节炎，其疗效可能与抑制炎症因子有关［21］.此外，原花青素A1和原花青素A2具有一定的抗过敏性，可以应用于治疗炎症和其他相关疾病［22］.这种快速、高效的分析方法有利于扩展黑骨藤化学成分类别，以期进一步研究其药理活性，为黑骨藤的药效物质基础研究及质量控制提供新的依据.

本研究还建立一测多评法，以隐绿原酸为内标，同时测定异绿原酸C、新绿原酸和绿原酸的含量，并对其可行性进行了探讨分析.结果可看出，一测多评法稳定有效，能高效准确地得到其他3种分析物的含量，降低生产测试成本，实现了黑骨藤多指标成分控制的目的，而且该方法操作简便，重复性好，可为其质量评价提供参考依据.