复用眼科手术器械表面多酶洗涤剂残留的影响因素研究

唐 媛 ，秦 蕾 ，李 丹 ，陈燕燕 ，陈 茹 ，黄小琼

1.温州医科大学眼视光学院（生物医学工程），浙江 325000；2.宁波卫生职业技术学院；3.温州医科大学口腔医学院附属口腔医院；4.温州医科大学附属眼视光医院 眼视光学和视学科学国家重点实验室

多酶洗涤剂中含有蛋白水解酶、淀粉酶、脂肪酶等多种酶蛋白，能迅速分解各种有机物，去除物体表面的污物，从而高效完成清洗过程。近年来，多酶洗涤剂在器械清洗方面得到了推广应用。据报道，87.1%的医院在清洗复用眼科手术器械时选用多酶洗涤剂[1]。然而，多酶洗涤剂在临床使用过程中仍存在一些问题，特别是在眼科手术器械的应用上，早在20世纪90年代，就有学者通过人眼离体角膜实验及兔眼、猪眼动物实验表明，多酶洗涤剂残留会造成毒性角膜内皮细胞破坏（toxic endothelial cell destruction,TECD）综合征[2]。Mamalis等[4⁃8]发现，多酶洗涤剂被带入兔眼内，可导致剂量依赖性的角膜肿胀、损伤及通透性增加[3]。随后多项研究亦表明，多酶洗涤剂残留可能是引起眼前节毒性反应综合征（toxic anterior segment syndrome,TASS）的一个原因。因此，关于眼科器械表面多酶洗涤剂的残留问题应该引起高度重视。多酶洗涤剂的主要成分是酶蛋白，其有效使用易受温度、浓度和时间等诸多因素的影响[9⁃12]。本研究旨在通过二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）法定量检测器械表面残留的多酶洗涤剂，研究不同的洗涤时间、漂洗水量、干燥温度及器械材质这4个因素对器械表面多酶洗涤剂残留量的影响，为规范眼科器械手工清洗方法、制定相关清洗标准流程提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究选取经高温高压蒸汽灭菌的新304不锈钢和钛合金眼科显微持针钳各2 000件，进行人工模拟器械表面多酶洗涤剂的残留。每件眼科器械均经过1∶270比例稀释的2 000 mL多酶洗涤剂洗涤（温度40℃）。洗涤过程中控制多酶洗涤剂的剂量、浓度、温度及器械的装载量，以保证器械表面附着等量的多酶洗涤剂。本研究为多组平行对照设计，采用随机数字表法将2 000件不锈钢眼科器械根据影响因素分为洗涤时间研究组、漂洗水量研究组、干燥温度研究组3大组，各组器械件数依次为600件、600件和800件。洗涤时间研究组根据器械洗涤时长随机分为3小组：2.0 min、3.5 min、5.0 min，每组200件；漂洗水量研究组根据器械漂洗水量随机分为3小组：0 mL、1 000 mL、2 000 mL，每组200件；干燥温度研究组根据器械干燥温度随机分为4小组：35℃、55℃、75℃、90℃，每组200件。每20件眼科器械表面残留多酶洗涤剂提取的样品计为1份，各小组的样品数均为10份。钛合金眼科器械分组采用以上相同方法。

1.2 研究方法

1.2.1 影响因素研究 ①洗涤时间：将眼科显微持针钳轴节充分打开，于多酶洗涤剂中洗涤2.0 min、3.5 min或5.0 min后取出，未经漂洗（使器械表面多酶洗涤剂的残留最大化），将器械轴节打开依次排列于器械框中，置于35℃干燥柜中干燥20 min，研究不同洗涤时间对器械表面多酶洗涤剂残留量的影响。②漂洗水量：将眼科显微持针钳轴节充分打开，于多酶洗涤剂中洗涤5 min后取出，置于室温流动纯水下漂洗，每批次漂洗水量为1 000 mL或2 000 mL，每批次5件手术器械，将器械轴节打开依次排列于器械框中，置于35℃干燥柜中干燥20 min，研究不同漂洗水量对器械表面多酶洗涤剂残留量的影响。③干燥温度：将眼科显微持针钳轴节充分打开，于多酶洗涤剂中洗涤5 min后取出，未经漂洗（使器械表面多酶洗涤剂的残留最大化），将器械轴节打开依次排列于器械框中，置于35℃、55℃、75℃或90℃干燥柜中干燥20 min，研究不同干燥温度对器械表面多酶洗涤剂残留量的影响。④器械材质：采用不锈钢和钛合金两种材质的眼科显微持针钳，进行上述①②③的实验操作，研究不同器械材质对器械表面多酶洗涤剂残留量的影响。

1.2.2 样品采集及检测方法 ①样品的采集：经同种清洗方法清洗完毕后的20件同材质眼科器械表面的残留多酶洗涤剂一并刷落于20 mL灭菌水中，得到1份含多酶洗涤剂的提取液样品。②BCA工作液及标准液的配制[13]：按50体积A液加1体积B液充分混匀，配制得到BCA工作液，每次实验现配现用。取适量25 mg/mL蛋白标准（bovineserum album，BSA），稀释至0.5 mg/mL，按梯度稀释的方法，用灭菌水分别稀释原标准品，配制成浓度分别为0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL的BCA系列标准液。③残留多酶洗涤剂的定量检测：在96孔板中依次加入200μL的BCA工作液，再依次加入BCA系列标准液和含有多酶洗涤剂的提取液样品各20μL，充分混匀，于37℃生化培养箱中孵育30 min后取出，用酶标仪测定标准液和样品在562 nm波长处的吸光度。以蛋白浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。根据标准曲线和样品的吸光度，即可计算出所测提取液样品中所含的酶蛋白浓度。

1.2.3 统计学方法 数据录入使用Excel 2019，由双人录入并检查一致性。采用SPSS 25.0统计学软件对数据进行统计描述及分析。定量资料采用均数±标准差（±s）描述，组间比较采用t检验及方差分析。所有显著性检验均为双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同洗涤时间不同材质器械的多酶洗涤剂残留量比较 3组洗涤时间器械表面多酶洗涤剂残留量的差异无统计学意义（P＞0.05）；两种材质器械表面多酶洗涤剂残留量的差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 不同洗涤时间不同材质器械的多酶洗涤剂残留量的比较(±s) 单位：μg/mL

表1 不同洗涤时间不同材质器械的多酶洗涤剂残留量的比较(±s) 单位：μg/mL

时间2.0 min 3.5 min 5.0 min F值P样本量10 10 10不锈钢30.448±7.676 31.153±7.579 31.506±11.502 0.035 0.966钛合金28.123±4.254 30.923±10.292 31.018±7.362 0.455 0.639 t值0.838 0.057 0.113 P 0.413 0.955 0.911

2.2 不同漂洗水量不同材质器械的多酶洗涤剂残留量比较 3组漂洗水量器械表面多酶洗涤剂残留量的差异有统计学意义（P＜0.001），组间比较后发现，除“漂洗1 000 mL”与“漂洗2 000 mL”两组之间差异无统计学意义（P＞0.05），两漂洗组与未漂洗组相比差异均有统计学意义（P＜0.001）；两种材质器械表面多酶洗涤剂残留量的差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 不同漂洗水量不同材质器械的多酶洗涤剂残留量的比较(±s) 单位：μg/mL

表2 不同漂洗水量不同材质器械的多酶洗涤剂残留量的比较(±s) 单位：μg/mL

水量0 mL 1 000 mL 2 000 mL F值P样本量10 10 10不锈钢31.506±11.502 16.328±4.606 15.113±3.161 15.308＜0.001钛合金31.018±7.362 15.961±3.059 13.843±3.400 35.030＜0.001 t值0.113 0.210 0.865 P 0.911 0.836 0.399

2.3 不同干燥温度不同材质器械的多酶洗涤剂残留量比较 4组干燥温度器械表面多酶洗涤剂残留量的差异无统计学意义（P＞0.05）；两种材质器械表面多酶洗涤剂残留量的差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 不同干燥温度不同材质器械的多酶洗涤剂残留量的比较(±s) 单位：μg/mL

表3 不同干燥温度不同材质器械的多酶洗涤剂残留量的比较(±s) 单位：μg/mL

温度35℃55℃75℃90℃F值P样本量10 10 10 10不锈钢31.506±11.502 33.312±7.380 39.040±7.968 37.094±9.044 1.427 0.251钛合金31.018±7.362 30.244±5.273 36.560±8.293 37.195±11.449 1.869 0.152 t值0.113 1.070 0.682−0.022 P 0.911 0.299 0.504 0.983

3 讨论

3.1 洗涤时间对眼科手术器械表面多酶洗涤剂残留量的影响 《WS 310.2−2016医院消毒供应中心第2部分：清洗消毒及灭菌技术操作规范》[14]和《我国眼科手术管理、感染控制、消毒灭菌指南》[15]均未对器械清洗选用的洗涤剂及洗涤时间做出规定，仅提出精密器械的清洗应遵循生产厂家提供的使用说明或指导手册。本研究严格参照多酶洗涤剂的使用说明书，将眼科显微持针钳轴节充分打开后，完全浸没于多酶洗涤剂中2～5 min。结果显示在说明书规定的2～5 min洗涤时间范围内，随着洗涤时间的延长，器械表面多酶洗涤剂残留量不发生显著变化。通过眼科手术器械浸没于多酶洗涤剂中，器械表面对多酶洗涤剂产生吸附现象，两者通过较弱的分子间引力相结合，形成物理吸附[16⁃17]。当多酶洗涤剂与器械充分接触一定时间后，系统达到平衡，两者的平衡吸附量取决于器械的性质、表面积及多酶洗涤剂的浓度、温度[16,18⁃19]。本研究采用相同规格的眼科显微持针钳及恒定浓度、温度的多酶洗涤剂，故平衡吸附量相等。在洗涤2 min甚至更短的时间内，器械表面对多酶洗涤剂的物理吸附已达到了平衡状态[20⁃21]，这可能是对器械表面多酶洗涤剂的残留量不随洗涤时间延长而增加的合理解释。因此，本研究建议医务工作者应严格参考多酶洗涤剂生产厂家的使用说明，在规定的洗涤时间范围内，结合器械的数量、结构复杂度及污染物的种类、严重程度，选择最佳的洗涤时间。

3.2 漂洗水量对眼科手术器械表面多酶洗涤剂残留量的影响 我国卫生行业标准规定的《WS 310.2−2016医院消毒供应中心第2部分：清洗消毒及灭菌技术操作规范》[14]、世界卫生组织（WHO）发布的《卫生保健机构医疗器械的消毒和后处理标准》[22]及亚太感染控制学会（APSIC）修订的《卫生保健机构器械消毒灭菌指南》[23]中,均未对器械清洗过程中的漂洗水量做出具体规定。国外有研究表明，使用多酶洗涤剂的白内障超声乳化针头经过细致的漂洗，其表面的残留物与未漂洗组相比显著减少[10]。邓杏灵等[24]建议眼科Phaco硅胶水管应以压力水枪用纯水反复冲洗管腔，清洗水流速≥12 mL/s，清洗时间≥50 s，清洗水量≥600 mL。此外，该研究还发现随着漂洗时间增加和漂洗水量增多，清洗效果明显提升。

本研究得出类似的结果，与未漂洗组相比，漂洗组的器械表面多酶洗涤剂残留量显著减少；与漂洗水量1 000 mL组相比，2 000 mL组的器械表面多酶洗涤剂残留量虽略微减少，但差异无统计学意义。可能原因是器械表面和多酶洗涤剂接触组成固液界面，两者间的物理吸附作用大小与器械表面的粗糙度有关[25⁃26]。器械内面光滑，相对表面积较小，与多酶洗涤剂的结合力较弱，易随漂洗水流而脱附；器械尖细弯曲的头部、滚花状的柄部及带有沟槽的卡锁部粗糙，相对表面积较大，与多酶洗涤剂的结合力较强，易嵌附多酶洗涤剂且粘附牢固，难以随漂洗水流彻底脱落。本研究结果表明，1 000 mL的漂洗水量足以去除器械表面附着不牢固的残留多酶洗涤剂；随着漂洗水量的增加，器械表面多酶洗涤剂残留量不会显著减少。因此，建议各医院在确保医疗手术器械彻底漂洗的安全基础上，适当节约水资源，实现降耗减排，达到“绿色医疗”的目标。减量化用水也有利于野战医院、健康快车等一系列便携式医疗建设项目的落地。

3.3 干燥温度对眼科手术器械表面多酶洗涤剂残留量的影响 器械清洗流程最后的干燥步骤大大降低了器械表面残留病原体存活和复制的风险[27]。若水分残留于器械表面，微生物可在数小时内繁殖100多万个菌落（CFU）[28]；残留的水分也可促进生物膜的形成[29⁃31]。《WS 310.2⁃2016医院消毒供应中心第2部分：清洗消毒及灭菌技术操作规范》[14]规定宜首选干燥设备进行干燥处理，根据器械的材质选择适宜的干燥温度，金属类干燥温度为70～90℃，塑胶类干燥温度为65～75℃。考虑到眼科器械材质多样性和临床实用性，本研究选取35℃、55℃、75℃和90℃4个干燥温度。本研究结果发现，随干燥温度的升高，器械表面多酶洗涤剂残留量不发生显著变化。有研究也证实多酶洗涤剂中的酶蛋白是极其稳定的，直到温度≥140℃酶蛋白的构象才会发生变性而失活[3]。本研究采用的干燥温度均≤90℃，因此不会使多酶洗涤剂中的酶蛋白失活。目前，临床最常使用的高温高压蒸汽灭菌法所采用的温度仅为132～134℃[32]，低于140℃。因此，器械在干燥前的充分漂洗至关重要。

3.4 器械材质对眼科手术器械表面多酶洗涤剂残留量的影响 钛合金具有轻如铝、硬如钢、健康环保、抑菌、抗酸碱、不生锈、生物兼容性好等优点，被广泛应用于骨科、口腔科、眼科等精密器械中，成为最有发展前景的医用材料之一[33]。但是钛合金材质的器械价格相对昂贵，部分医院应用的仍是的不锈钢材质眼科手术器械。本研究发现，两种材质的眼科手术器械经过相同的洗涤、漂洗、干燥等清洗流程，除干燥温度为90℃的小组外，其余各小组钛合金手术器械表面多酶洗涤剂残留量均略低于不锈钢，这可能与钛合金应用到手术器械表面通常会进行表面氧化处理有关。有研究指出镍钛器械经过热氧化处理后，表面应力值减少，表面电荷、电力功函数增加，从而使得表面吸附力降低[34]。本研究纳入的钛合金器械是由TC4材料经过阳极氧化处理所得，器械表面有一层氧化钛膜，较无氧化钛膜的不锈钢器械具有较低的表面吸附力。吸附力的降低使得器械表面的多酶洗涤剂更易随水流漂洗而脱落。虽然钛合金器械比不锈钢器械成本高，但是钛合金材质器械表面多酶洗涤剂的残留量较少，降低了二次清洗的机会，节约了器械再处理的成本；且钛合金器械具有更强的抗腐蚀性、抗塑性变形和抗扭转断裂等优势[34]。因此，建议医院管理者应充分考虑运营效率及成本管控，尽量使用钛合金材质的眼科手术器械。

4 小结与展望

本研究通过定量检测清洗后眼科手术器械表面多酶洗涤剂的残留量，结果提示洗涤时间、干燥温度、器械材质均不会影响器械表面多酶洗涤剂的残留量，漂洗可有效减少器械表面残留的多酶洗涤剂。基于此，本研究建议眼科手术器械最佳洗涤时间为2～5 min（多酶洗涤剂说明书要求），每批次手术器械漂洗水量为1 000 mL，干燥温度宜根据器械材质选择合适的温度，器械材质建议选择钛合金。但本研究只纳入临床应用广泛的不锈钢及钛合金两种材质手术器械，不能代表全部材质的手术器械；在手术器械种类的选择上，仅纳入眼科显微持针钳一种器械，亦不能代表临床应用的所有类型器械。下一步可将玻璃、硅胶、塑料等不同材质的医疗器械及口腔科、骨科、消化科等不同类型的器械纳入后续的研究中。