不同存储温度的huMSC-exo对UVB辐照HaCaT细胞的修复作用研究

2021-09-13 02:06章毅陈侃俊伍婷李品宙胡肖希孔凡瑞祁成陈亮
中国医药生物技术 2021年4期
关键词:外泌体孵育存活率

章毅,陈侃俊,伍婷,李品宙,胡肖希,孔凡瑞,祁成,陈亮

·论著·

不同存储温度的huMSC-exo对UVB辐照HaCaT细胞的修复作用研究

章毅*,陈侃俊*,伍婷,李品宙,胡肖希,孔凡瑞,祁成,陈亮

200051 上海,中国干细胞集团有限公司/中国干细胞集团上海生物科技有限公司/中国干细胞集团海南博鳌附属干细胞医院有限公司/上海市脐带血造血干细胞库/上海市干细胞技术有限公司

探究了不同存储温度的 huMSC-exo 对 UVB 辐照 HaCaT 细胞的修复作用,为外泌体存储选择适宜的温度条件提供理论依据。采用超速离心法从 huMSC 培养基上清中提取外泌体,用 Western blot、纳米颗粒跟踪分析技术和透射电镜技术进行表征,并置于–80、–20、4、25 和 45 ℃存储 1、3、7、14、30、50、100 和 150 d。构建 UVB 辐照 HaCaT光老化细胞模型,用 huMSC-exo 处理 24 h 后观察细胞形态、检测细胞存活率、SA-β-gal 活性、T-SOD 活性、MDA 和 LDH 含量。huMSC-exo 呈具有清晰膜的茶托样结构,尺寸中位数为 114 nm,30 ~ 150 nm 囊泡数量占比约61.42%,表达外泌体表面标记蛋白 CD9、CD63 和 CD81。–80 ℃和25 ℃存储 1 ~ 150 d 的 huMSC-exo 能显著提高 UVB 辐照 HaCaT 细胞存活率、恢复细胞形态、降低 SA-β-gal 活性、部分恢复细胞 T-SOD、MDA 和 LDH 水平;–20 ℃存储的 huMSC-exo 对 HaCaT 的增殖活性、细胞形态和SA-β-gal 活性有恢复作用;4 ℃存储的 huMSC-exo 能减轻细胞老化水平;45 ℃存储的 huMSC-exo 无显著修复作用。–80 ℃、25 ℃存储的 huMSC-exo 能够显著恢复 UVB 辐照引起的 HaCaT 损伤,–20 ℃、4 ℃ huMSC-exo 作用效果次之,45 ℃的 huMSC-exo 无显著影响,提示–80 ℃和 25 ℃能够较好地维持huMSC-exo 的生物学功能。

外泌体; 间充质干细胞; HaCaT 细胞; UVB 辐照

皮肤老化可以分为内在老化和外在老化两种类型,后者又称光老化。阳光照射,尤其是暴露于紫外线 B(ultraviolet B,UVB)是导致皮肤光老化的主要因素,其还会引起机体活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)积聚、TNF-α、IL-1α、IL-16、IL-10 和 IL-8 等炎症因子激活及皮肤慢性炎症[1]。外泌体是细胞外囊泡(extracellular vesicle,EV)的主要类型之一,直径 30 ~ 150 nm,含有多种生物大分子,包括编码 RNA、非编码 RNA、DNA、蛋白质和脂质等,可由几乎所有类型的细胞分泌。研究表明,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)或皮肤细胞来源的外泌体能够延缓皮肤光老化[2]、加速创伤皮肤愈合[3]、激活角质细胞并提升皮肤防御能力[4-7],是皮肤老化及创伤修复的极具潜力的无细胞活性组分。

研究指出,外泌体的物理性质因存储条件的不同而改变,如尺寸减小、膜电位升高、蛋白质含量降低等,其中存储温度是影响外泌体物理性质的关键因素[8]。然而,目前关于存储条件对外泌体生物学活性和稳定性的影响鲜有报道。探究优化外泌体存储条件以维持其在存储过程中的生物活性,是保障外泌体临床前研究结果的可重复性、临床应用的有效性、建立标准化和规模化的外泌体制备、存储及应用产业链的重要前提和关键。

本研究通过 UVB 辐照 HaCaT 细胞构建了人表皮光老化损伤模型,探究并比较不同存储温度条件下人脐带间充质干细胞源外泌体(human umbilical cord MSC-derived exosome,huMSC-exo)对 HaCaT 的潜在修复作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与耗材 采集足月产健康新生儿脐带,经产妇或家属签署知情同意书后获得,符合国家相关法律和伦理委员会规定。CCK8 试剂盒购自碧云天公司;BCA 检测试剂盒、β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性检测试剂盒购自美国 Sigma 公司;CD9、CD63、CD81 抗体购自 Abcam 公司;FBS、DMEM、0.25% Typsin-EDTA、L-谷氨酰胺购自美国 Gibco 公司;青霉素-链霉素溶液购自德国 PAN-biotech 公司;0.22 μm 无菌滤器、细胞培养瓶、24 孔板购自美国Corning 公司;总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)检测试剂盒购自南京建成公司。

1.1.2 仪器 Varioskan LUX 多功能酶标仪、ST-16R 低温离心机、MTX 150 超速离心机、ULTS1368 低温冰箱购自美国 Thermo 公司;1800 系列-190 气相液氮罐购自美国 MVE 公司;自动细胞计数仪购自美国 Invitrogen 公司;预制胶凝胶蛋白电泳系统、iblot2 干式转印系统等购自美国 Life 公司;ChemiDoc 化学发光成像分析系统购自美国 Bio-Rad 公司;FYL-YS-150L 温控干燥孵育箱购自福意公司;TS100 倒置相差显微镜、DS-U3 显微镜相机控制器购自日本 Nikon 公司;纳米颗粒跟踪分析仪 ZetaView PMX 110 购自德国 Particle Metrix 公司;透射电子显微镜购自德国 Leica 公司。

1.2 方法

1.2.1 huMSC 的分离培养与上清收集 取脐带华通胶剪碎成约 2 mm3的组织块,加入 II 型胶原酶 37 ℃恒温消化 1.5 h,收集滤液室温 2000 r/min 离心 10 min,收集细胞沉淀加入含 10% FBS 的 DMEM 培养基重悬,置于 37 ℃、5% CO2恒温培养箱内进行培养,待细胞融合度达到 85% ~ 90% 时,用 0.25% 胰酶消化传代,接种密度为 5 × 104/ml,每 2 天为细胞全量换液,每 3 ~ 4 天传代 1 次。取 P3 ~ P6 代次 huMSC,接种 24 h 后换无血清培养基,待细胞融合度达到 85% ~ 90% 时,用无菌瓶收集细胞上清。

1.2.2 huMSC-exo 的制备、存储与复温 取 P3 ~ P6 代 huMSC 培养基上清,分装于 50 ml 离心管中,室温 2500 r/min 离心 10 min,去除细胞碎片;收集上清,置于新的 50 ml 离心管中,室温10 000 r/min 离心 20 min;收集上清,过 0.22 μm 无菌滤器,滤液置于超速离心管中,4 ℃ 100 000 ×离心 270 min;离心结束后,用少量 PBS(3 ~ 5 ml)轻轻冲洗沉淀 1 次,最后用 PBS(约 2 ml,pH = 7.4)溶解、混匀沉淀,得到 huMSC-exo。按照 BCA 试剂盒说明书测定总蛋白浓度。外泌体分装后置于–80、–20、4、25 和 45 ℃冰箱或孵育箱中存储。同时,应按照 1 ~ 150 d 的冻存时长间隔,取同一个体来源的 P3 ~ P6 代次 huMSC 上清进行 huMSC-exo 制备,并确保各存储温度、同一存储时长的 huMSC-exo 均制备来自同一批次、同一代次 huMSC 上清。复温时,将 huMSC-exo 从冰箱或孵育箱中取出,室温静置,待完全溶解后,用无血清 DMEM 配制成 huMSC-exo 终浓度为 44 μg/ml的培养体系,可避免 huMSC-exo 反复冻融。

1.2.3 HaCaT UVB 辐照损伤模型的建立与huMSC-exo 处理 将 HaCaT 细胞接种于 24 孔板中,接种密度为 1 × 105/ml,待细胞融合度达到 30%,换成无血清 DMEM 继续培养,当细胞融合度达到 50%,弃去 DMEM 培养基,每孔加入 500 μl PBS,将 UVB 辐照组、huMSC-exo 组置于 UVB 光源正下方 6 cm 处,辐照强度为 2.85 μW/cm2,辐照时间 30 s,累计辐照剂量 8.55 mJ/cm2。随后,立即弃去 PBS,加入含不同存储条件 huMSC-exo 的培养基,对照组和 UVB 辐照组添加等体积 PBS。

1.2.4 纳米颗粒跟踪分析技术检测 huMSC-exo 粒径 取 PBS 稀释的 huMSC-exo,根据操作手册检测样本粒径大小及分布,使用 110 nm 聚苯乙烯颗粒进行校准,测定温度为25 ℃。

1.2.5 Western blot 检测 huMSC-exo 表面标志性蛋白 按照试剂盒说明书进行细胞裂解和总蛋白抽提,BCA 法测定总蛋白浓度。huMSC-exo 样本上样量为 10 μg,经过 12% SDS-PAGE 凝胶电泳后通过 iblot2 干式转印系统将蛋白转移到 PVDF 膜上,封闭液封闭 1 h,采用 ECL 法进行抗体孵育和显色,孵育条件为CD9(1:1000)、CD63(1:1000)和CD81(1:1000)4 ℃摇床孵育过夜。孵育结束后 PBS 漂洗 2 次,加入 HRP 工作液,室温振荡孵育 10 min,PBS 漂洗 2 次,加入检测液孵育 5 min,通过 ChemiDoc 化学发光成像分析仪进行显影分析。

1.2.6 透射电镜鉴定 huMSC-exo 形态 取 PBS 重悬的 huMSC-exo 100 μl,室温静置 5 min,加入染色剂醋酸铀水溶液(2%,pH = 4.0)进行阴性染色,混匀后用移液枪将样本滴加到 200 目复膜铜网上,自然干燥后置于透射电子显微镜下观察,拍摄 huMSC-exo 电镜照片。

1.2.7 CCK8 法检测 HaCaT 细胞增殖 按照 1.2.3 所述方法于 24 孔板培养和处理HaCaT 细胞。huMSC-exo 处理 24 h 后,每孔加入 100 μlCCK8 工作液,37 ℃孵育 3 h,酶标仪检测 450 nm吸光值。

1.2.8 SA-β-gal活性检测 按照 1.2.3 所述方法培养和处理 HaCaT 细胞。huMSC-exo 处理 24 h 后,按照试剂盒说明书检测细胞 SA-β-gal 活性,倒置相差显微镜下随机选取 10 个视野,每个视野细胞数约 100 个,计数阳性染色细胞数。

1.2.9 T-SOD、MDA 和 LDH 含量检测 按照 1.2.3 所述方法培养和处理 HaCaT 细胞,24 h 后收集培养基上清液,按照试剂盒说明书检测 T-SOD、MDA 和 LDH 水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 huMSC-exo 鉴定结果

本研究制备的 huMSC-exo 具有清晰膜轮廓,呈茶托样结构(图 1A),粒径分布范围 30 ~ 590 nm,中位数 114 nm,30 ~ 150 nm的囊泡数量占比约 61.42 %(图 1B),表达 CD9、CD63 和 CD81(图 1C)。根据国际细胞外囊泡协会对外泌体的判定标准[9],本研究huMSC-exo 是以外泌体为主的细胞外囊泡。

2.2 huMSC-exo 对 UVB 辐照 HaCaT 增殖与形态的影响

未经 UVB 辐照的 HaCaT 细胞联结成片,呈扁平铺路石状排列,UVB 辐照后细胞贴壁能力降低,呈梭形或不规则形状,细胞间隙增加(图 2A),细胞存活率降低至对照组的 0.31倍(图 2B,< 0.001)。25 ℃和–80 ℃存储 1 ~ 150 d 的 huMSC-exo 处理均能显著提高辐照后 HaCaT 细胞存活率,改善细胞形态和贴壁能力;–20 ℃存储的huMSC-exo 恢复作用次之,4 ℃和45 ℃huMSC-exo 处理对细胞存活率无显著影响,提示存储温度是huMSC-exo 的活性和生物学功能的影响因素(图 2C)。不同温度下存储 150 d 的存活率结果显示,–80 ℃、–20 ℃和25 ℃ huMSC-exo 处理组 HaCaT 细胞存活率分别显著提高至 UVB 辐照组的 1.17 倍(< 0.001)、1.10 倍(< 0.05)和 1.21 倍(< 0.001)(图 2D),与形态学观察结果一致。

图1 huMSC-exo 鉴定结果(A:形态观察;B:粒径分布;C:标志性蛋白表达)

Figure 1 Characteristics of huMSC-exo (A: Morphology; B: Particle size distribution; C: Expression of CD9, CD63 and CD81)

图2 huMSC-exo 对 UVB 辐照 HaCaT 存活率的影响(A:不同温度存储 150 d 的 huMSC-exo 对 HaCaT 形态的影响,40 ×,其中,a:采用 UVB 辐照,b ~ f:在接受辐照后分别用–80 ℃、–20 ℃、4 ℃、25 ℃和 45 ℃存储的 huMSC-exo 处理;B:UVB 辐照显著降低 HaCaT 存活率;C:不同温度存储 1 ~ 150 d的 huMSC-exo 对 HaCaT 存活率的影响;D:不同温度下存储 150 d 的 huMSC-exo 对 HaCaT 存活率的影响;*P < 0.05,***P < 0.001)

Figure 2 Effects of huMSC-exo treatment on UVB irradiated HaCaT cells (A: Effects of huMSC-exo stored at different temperature for 150 days on HaCaT cell morphology, 40 ×, a: cells were treated with equal volume of PBS after UVB irradiation, b - f: cells were treated with huMSC-exo stored at –80 ℃, –20 ℃, 4 ℃, 25 ℃and 45 ℃ after UVB irradiation; B: UVB irradiation significantly reduced cell viability; C: Effects of huMSC-exo stored at different temperature for 1 to 150 days on HaCaT cell viability; D: Effects of huMSC-exo stored at different temperature for 150 days on HaCaT cell viability;*< 0.05,***< 0.001)

2.3 huMSC-exo 对 UVB 辐照 HaCaT 细胞衰老的影响

SA-β-gal 是反映细胞衰老水平的重要指标,其活性随着细胞衰老而增加。本研究检测了不同温度下存储 1、7、50 和 150 d 的 huMSC-exo 对 UVB 辐照 HaCaT 细胞 SA-β-gal活性的影响(图 3)。UVB 对照组的阳性染色面积为 41%,各存储时长条件下–80 ℃、–20 ℃、4 ℃、25 ℃和 45 ℃ huMSC-exo 处理组的平均阳性染色面积分别为8%、16%、29%、11% 和 43%,–80、25 和–20 ℃存储的 huMSC-exo 能显著降低 UVB 辐照引起的细胞 SA-β-gal 活性升高,4 ℃存储 huMSC-exo 作用效果次之,45 ℃存储 huMSC-exo 对SA-β-gal活性无影响,表明在适宜温度条件下存储的 huMSC-exo 具有光老化修复作用。

图3 huMSC-exo 对 UVB 辐照 HaCaT 细胞 SA-β-gal 活性的影响(A:SA-β-gal 染色情况;B:计算随机视野下 100 个细胞着色情况,估算 SA-β-gal 染色阳性面积百分比)

Figure 3 SA-β-gal activity of HaCaT treated with huMSC-exo (A: SA-β-gal staining in the different groups; B: Estimation of positive area percentage of SA-β-gal staining by analyzing random 100 cells in each group)

图4 不同温度存储 150 d huMSC-exo 对 UVB 辐照 HaCaT T-SOD(A)、MDA(B)和 LDH(C)的影响(*P < 0.05,**P < 0.01)

Figure 4 Effects of huMSC-exo stored at different temperatures for 150 d on T-SOD (A), MDA (B) and LDH (C) levels of UVB irradiated HaCaT cells (*< 0.05,**< 0.01)

2.4 huMSC-exo 对 UVB 辐照HaCaT T-SOD、MDA 和 LDH 水平的影响

–80 ℃和 25 ℃存储的 huMSC-exo 处理能不同程度地提高 UVB 辐照 HaCaT 细胞 T-SOD 活力、降低 MDA 和 LDH 分泌量(< 0.05 或< 0.01);–20 ℃和 4 ℃存储的 huMSC-exo 也具有降低细胞 LDH 分泌的作用(< 0.05),对 T-SOD 活性和 MDA 含量无显著影响;45 ℃存储的huMSC-exo 对 UVB 辐照后 HaCaT T-SOD、MDA 和 LDH 都无显著影响(图 4)。这些结果与细胞存活率及 SA-β-gal 活性检测结果一致,提示huMSC-exo 对 UVB 辐照损伤的修复作用可能与修复细胞氧化还原状态并降低细胞毒性损伤有关。

3 讨论

紫外线,尤其是 UVB(290 ~ 320 nm)辐照是引起皮肤光老化的主要原因,会导致皮肤细胞产生过量活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS),包括单线态氧、超氧阴离子和过氧化氢,并引起皮肤细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的异常合成与降解,最终导致皮肤老化[10]。

研究发现,以往被认为是“细胞排泄物”的外泌体不仅在细胞及组织间通讯中扮演关键角色[11],_ENREF_3_ENREF_7 具有免疫调节作用[12]和为难治性疾病提供早期诊断生物标志物的潜力[13],在皮肤学领域也有着广泛的应用前景,例如:能够调控细胞衰老并减轻皮肤老化[14]、促进皮肤创伤修复[15]、缓解皮肤炎症[16]、减少皮肤瘢痕形成[17]等。人真皮细胞来源 EVs 能够向人表皮细胞迁移并促进细胞划痕愈合,通过 miR-23a-3p 改善皮肤细胞衰老相关分泌表型[18]。Deng 等[2]研究发现,huMSC-exo 预处理能够显著降低 UVB 辐照人真皮成纤维细胞的 ROS 水平,提高谷胱甘肽过氧化物酶 1(glutathione peroxidase 1,GPX-1)、T-SOD 和过氧化氢酶(catalase,CAT)的活性及 mRNA 表达水平,预防人真皮成纤维细胞光老化。本研究用 huMSC-exo 处理 UVB 辐照后的 HaCaT 细胞,发现能够显著改善其细胞形态、促进细胞增殖,增加细胞 T-SOD 活力,降低 SA-β-gal 水平和 MDA、LDH 含量,与文献研究结果一致,提示 huMSC-exo可能通过调节皮肤细胞氧化还原状态发挥光老化修复作用。

尽管外泌体的生物学作用外沿被不断拓宽,但人们对如何保存外泌体以最大程度维持其活性功能却并未十分明确。研究指出,制备后的外泌体在保存过程中,会出现囊泡粒径缩小、囊泡数量增加、膜电位降低、完整性破坏和内容物析出等改变,影响外泌体的生物学功能[19],但 Bosch 等[20]却发现随着存储时间的延长,囊泡会发生聚集,从而引起数量减少。影响外泌体存储活性、尺寸及亚型浓度的可能因素众多,包括:存储温度、时长、溶剂及其 pH、外泌体来源及样本新鲜程度、制备方法等,其中温度被认为是影响外泌体尺寸、形态和内容物完整性的关键因素[21-23]。

在本研究中,–80 ℃和 25 ℃存储的 huMSC-exo 均能显著修复 UVB 辐照引起的HaCaT 损伤,表明深低温和常温保存均能较好地维持外泌体的光老化修复活性。有趣的是,–20 ℃和 4 ℃存储的 huMSC-exo 的恢复作用不及–80 ℃或 25 ℃存储的 huMSC-exo,提示这并不是维持 huMSC-exo 生物学功能的最佳存储温度。尽管本研究用于处理细胞的 huMSC-exo 不存在反复冻融情况,但–20 ℃和–80 ℃均不可避免地存在一次 huMSC-exo 冻融,4 ℃存储虽然未经冻融但降温幅度较大,提示外泌体内蛋白质、核酸等内容物在该温度下并不稳定,25 ℃则是最接近 huMSC-exo 原料收集、制备和后续实验的操作温度。这些结果提示降温、冻融和冻存后应用状态等复合因素都可能影响 huMSC-exo 的生物学活性,对于 huMSC-exo 存储应尽可能减少制备到应用全过程的温度变化,选择能够较好地维持其膜结构和内容物完整性及稳定性的存储温度以帮助维持其功能活性。Oosthuyzen 等[24]在常温储存 28 h 的血清

外泌体中检测发现 CD63 和 TSG101 表达不变;Jin 等[25]发现,血浆外泌体在常温储存实验周期内(0 ~ 48 h)RNA 含量不变,然而,尿液常温储存1 周,外泌体产量随着存储时间的延长而降低[26],表明外泌体经过制备及其来源的不同在常温条件下的存储稳定性可能存在差异。目前,外泌体通常于–80 ℃存储,尽管对外泌体存储的最适温度依然缺乏足够证据支持,但苛刻的深低温存储无疑也成为限制外泌体应用的重要因素。本研究结果支持了 huMSC-exo 常温存储、运输和应用的可行性。

本研究结果也表明,huMSC-exo 不适宜在高温条件下存储。Schulz 等[27]提取了 B 淋巴细胞源 EV 并测试其在 37 ℃、50 ℃、70 ℃、100 ℃和高压蒸汽处理条件下的稳定性,发现随着高温处理时间的延长,EV 粒径尺寸和颗粒浓度降低、蛋白浓度升高,100 ℃ EV的粒径比 37 ℃ EV 更小,表明高温会造成囊泡缩小或裂解。Park 等[8]通过蛋白免疫印迹分析发现,外泌体在 4 ℃、–20 ℃和–70 ℃保存 25 d 依然表达外泌体标志性蛋白 CD63 和CD81,37 ℃条件下保存 16 d 开始不表达 CD63 和 CD81。本研究中,45 ℃存储 1 ~ 150 d 的 huMSC-exo 对 UVB 辐照 HaCaT 的细胞形态、增殖活性、老化水平等均没有明显修复作用,表明即使是短时间较高温存储也会破坏 huMSC-exo 的生物学活性,如对表皮细胞的光老化修复作用,提示在外泌体的存储、运输、应用制剂制备等环节均应避免高温。

我们在制备 huMSC-exo 后 1 ~ 150 d 的存储周期内选取了多个时间点对其生物学功能进行研究,存活率检测结果显示,各相同存储温度下 huMSC-exo 对 HaCaT 存活率的促进作用均随着存储时间的延长先下降后升高,这可能是由于同一存储时长的 huMSC-exo 均同时制备自同一代次huMSC,而存储 150 d 的 huMSC-exo 来源 huMSC代次最低,提示huMSC-exo 的功能和来源细胞的代次有关。HuMSC-exo 对 SA-β-gal 活性的影响则未随着存储时间延长显示出明显规律。这些结果提示在外泌体相关产品开发和临床应用时应注重来源质量、制备工艺及批次一致性,以保障功效稳定性[8]。

综上所述,本研究发现 huMSC-exo 在 –80 ℃、25 ℃存储长达 150 d 后对 HaCaT 细胞依然具有 UVB 损伤修复功能,–20 ℃保存的 huMSC-exo 作用效果次之,45 ℃ huMSC-exo 无修复作用,提示外泌体制备、存储和应用各环节应避免高温,同时,在适宜的温度条件下 huMSC-exo 或可长期存储并维持其功能活性。然而,我们从功效角度探究了不同存储温度 huMSC-exo 的光老化修复作用,未明确相应条件下其内容物组成及含量、囊泡结构等改变。接下来,我们将利用荧光标记、RNA 测序等技术进一步分析不同存储条件下 huMSC-exo 的改变及光老化修复作用机制,为 huMSC-exo 的存储、运输和产业化应用提供理论支持。

[1] Kim JM, Kim SY, Noh EM, et al. Reversine inhibits MMP-1 and MMP-3 expressions by suppressing of ROS/MAPK/AP-1 activation in UV-stimulated human keratinocytes and dermal fibroblasts. Exp Dermatol, 2018, 27(3):298-301.

[2] Deng M, Yu Z, Li D, et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived and dermal fibroblast-derived extracellular vesicles protect dermal fibroblasts from ultraviolet radiation-induced photoaging in vitro. Photochem Photobiol Sci, 2020, 19(3):406-414.

[3] Shafei S, Khanmohammadi M, Heidari R, et al. Exosome loaded alginate hydrogel promotes tissue regeneration in full-thickness skin wounds: an in vivo study. J Biomed Mater Res A, 2020, 108(3):545- 556.

[4] Vallhov H, Johansson C, Veerman RE, et al. Extracellular vesicles released from the skin commensal yeast malassezia sympodialis activate human primary keratinocytes. Front Cell Infect Microbiol, 2020, 10:6.

[5] Zheng K, Wu W, Yang S, et al. Bone marrow mesenchymal stem cell implantation for the treatment of radioactivity-induced acute skin damage in rats. Mol Med Rep, 2015, 12(5):7065-7071.

[6] Salvolini E, Orciani M, Vignini A, et al. Skin-derived mesenchymal stem cells (S-MSCs) induce endothelial cell activation by paracrine mechanisms. Exp Dermatol, 2010, 19(9):848-850.

[7] Kim S, Lee SK, Kim H, et al. Exosomes secreted from induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells accelerate skin cell proliferation. Int J Mol Sci, 2018, 19(10):3119.

[8] Park SJ, Jeon H, Yoo SM, et al. The effect of storage temperature on the biological activity of extracellular vesicles for the complement system. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 2018, 54(6):423-429.

[9] Lötvall J, Hill AF, Hochberg F, et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles, 2014, 3:26913.

[10] Mohamed MA, Jung M, Lee SM, et al. Protective effect of disporum sessile D.Don extract against UVB-induced photoaging via suppressing MMP-1 expression and collagen degradation in human skin cells. J Photochem Photobiol B, 2014, 133:73-79.

[11] Zhao Y, Yin L, Zhang H, et al. Eph/ephrin family anchored on exosome facilitate communications between cells. Cell Biol Int, 2018, 42(11):1458-1462.

[12] Liu M, Wang JS, Liu MY, et al. Study of immunomodulatory function of exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Natl Med J China, 2015, 95(32):2630-2633. (in Chinese)

刘明, 汪劲松, 刘沐芸, 等. 人脐带间充质干细胞外泌体免疫调节功能的研究. 中华医学杂志, 2015, 95(32):2630-2633.

[13] Yao ZY, Chen WB, Shao SS, et al. Role of exosome-associated microRNA in diagnostic and therapeutic applications to metabolic disorders. J Zhejiang Univ Sci B, 2018, 19(3):183-198.

[14] Xu D, Tahara H. The role of exosomes and microRNAs in senescence and aging. Adv Drug Deliv Rev, 2013, 65(3):368-375.

[15] Wang L, Abhange KK, Wen Y, et al. Preparation of engineered extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells with ultrasonication for skin rejuvenation. ACS Omega, 2019, 4(27):22638-22645.

[16] Li C, Guo F, Wang X, et al. Exosome-based targeted RNA delivery for immune tolerance induction in skin transplantation. J Biomed Mater Res A, 2020, 108(7):1493-1500.

[17] Casado-Díaz A, Quesada-Gómez JM, Dorado G. Extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells (MSC) in regenerative medicine: applications in skin wound healing. Front Bioeng Biotechnol, 2020, 8:146.

[18] Terlecki-Zaniewicz L, Pils V, Bobbili MR, et al. Extracellular vesicles in human skin: Cross-talk from senescent fibroblasts to keratinocytes by miRNAs. J Invest Dermatol, 2019, 139(12):2425-2436.e5.

[19] Richter M, Fuhrmann K, Fuhrmann G. Evaluation of the storage stability of extracellular vesicles. J Vis Exp, 2019, (147).

[20] Bosch S, de Beaurepaire L, Allard M, et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep, 2016, 6:36162.

[21] Paulaitis M, Agarwal K, Nana-Sinkam S. Dynamic scaling of exosome sizes. Langmuir, 2018, 34(32):9387-9393.

[22] Almizraq RJ, Holovati JL, Acker JP. Characteristics of extracellular vesicles in red blood concentrates change with storage time and blood manufacturing method. Transfus Med Hemother, 2018, 45(3):185- 193.

[23] Jeyaram A, Jay SM. Preservation and storage stability of extracellular vesicles for therapeutic applications. AAPS J, 2017, 20(1):1.

[24] Oosthuyzen W, Sime NE, Ivy JR, et al. Quantification of human urinary exosomes by nanoparticle tracking analysis. J Physiol, 2013, 591(23):5833-5842.

[25] Jin Y, Chen K, Wang Z, et al. DNA in serum extracellular vesicles is stable under different storage conditions. BMC Cancer, 2016, 16(1): 753.

[26] Enderle D, Spiel A, Coticchia CM, et al. Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel Spin column-based method. PLoS One, 2015, 10(8):e0136133.

[27] Schulz E, Karagianni A, Koch M, et al. Hot EVs - how temperature affects extracellular vesicles. Eur J Pharm Biopharm, 2020, 146:55- 63.

The recovery effects of huMSC-exo stored at different temperatures on UVB irradiated HaCaT cells

ZHANG Yi, CHEN Kan-jun, WU Ting, LI Pin-zhou, HU Xiao-xi, KONG Fan-rui, QI Cheng, CHEN Liang

Author Affiliation: China Stem Cell Group Co., Ltd. / China Stem Cell Group Shanghai Biotechnology Co., Ltd. / China Stem Cell Group Affiliated Stem Cell Hospital Boao Hainan Co., Ltd. / Shanghai Cord Blood Bank/Shanghai Stem Cell Technology Co., Ltd, 200051 Shanghai, China

To investigate the recovery effects of huMSC-exo stored at different temperatures on UVB irradiated HaCaT cells.Exosomes were extracted from the medium supernatant of huMSC by ultracentrifugation and characterized by Western blot, nanoparticle tracking analysis and transmission electron microscopy. huMSC-exo were separated and stored at –80 ℃, –20 ℃,4 ℃, 25 ℃ and 45 ℃ for 1 day, 3 days, 7 days, 14 days, 30 days, 50 days, 100 days and 150 days. huMSC-exo was then added to UVB irradiated HaCaT cells. After 24 h incubation, cell viability of haCaT was measured by CCK8 assay and cell morphology was photographed. The activities of SA-β-gal and T-SOD, the contents of MDA and LDH were detected by commercial kit.The huMSC-exo showed a typical saucer-like structure with clear membrane. The median particle size was 114 nm, and the proportion of vesicles within the size range of 30 - 150 nm was about 61.42%. Besides, huMSC-exo expressed marker proteins CD9, CD63 and CD81. huMSC-exo stored at –80 ℃ and 25 ℃ for 1 - 150 d significantly improved the cell viability of UVB irradiated HaCaT cells, reduced the activity of SA-β-gal, and restored cell morphology, T-SOD, MDA and LDH levels. huMSC-exo stored at –20 ℃ also showed beneficial effects on the cell proliferation, morphology and cell aging of HaCaT cells. huMSC-exo stored at 4 ℃ decreased SA-β-gal activity. However, huMSC-exo stored at 45 ℃ could not recover UVB induced damage of HaCaT cells.huMSC-exo stored at –80 ℃ and 25 ℃ shows a significant repair effect on UVB irradiated HaCaT cells, followed by huMSC-exo stored at –20 ℃ and 4 ℃, while huMSC-exo stored at 45 ℃ exerts no significant recovery effect on HaCaT cells. These results suggests that the biological functions of huMSC-exo can be relatively well maintained at –80 ℃ and 25 ℃.

exosome; mesenchymal stem cells; HaCaT cells; UVB irradiation

WU Ting, Email: wuting@shanghaicordblood.org

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.04.004

伍婷,Email:wuting@shanghaicordblood.org

2020-12-24

*同为第一作者

猜你喜欢
外泌体孵育存活率
扳机日血清雌激素不同水平时授精前后卵母细胞孵育时间对短时受精胚胎移植结局的影响
外泌体miRNA在肝细胞癌中的研究进展
前言
——外泌体与老年慢性疾病相关性的研究进展
园林绿化施工中如何提高植树存活率
间充质干细胞外泌体在口腔组织再生中的研究进展
循环外泌体在心血管疾病中作用的研究进展
日本癌症10年平均存活率为57.2%,胰腺癌最低仅5.3%
用课程“孵育”会“发光”的教室
损耗率高达30%,保命就是保收益!这条70万吨的鱼要如何破存活率困局?
军事电子专业研究生创新能力的孵育与拓展