溶磷复合菌剂筛选及其对山核桃幼苗的生物学效应

萧利珠 郑文秀 陈铭炯 褚鑫健 李财运 倪钟涛 王正加 周 湘

(浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室，浙江杭州 311300)

山核桃(Carya cathayensisSarg.) 是胡桃科(Judlandaceae)山核桃属(CaryaNutt.)植物，是我国特有的一种木本油料和干果经济树种[1]。山核桃主要分布于浙皖交界的天目山区，该地区的石灰性土壤会引起有效磷的流失，从而导致山核桃植株果实发育受阻，影响品质与产量[2]。施加磷肥可短期补充有效磷，但会破坏土壤结构，不利于可持续经营[3－4]，且磷素沉降流失不仅会引发环境污染，还可能危害人体健康[5]。因此，如何有效利用土壤中难溶的磷素，更好地促进植物的生长，是目前山核桃栽培中亟需解决的问题。有报道指出，土壤中存在广泛的溶磷微生物，如假单胞菌(Pseudomonas)、芽孢杆菌(Bacillus)、曲霉(Aspergillus)和青霉(Penicillium)属[6－7]等。这些微生物制成的菌剂可显著促进草本植物的生长，如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)对玉米(Zea maysL.)[8]具有增产作用，某些假单胞菌和芽孢杆菌菌株对福鼎大白茶(Camellia sinensis.cv.Fuding-dabaicha)[9]、枫香(Liquidambar formosanaHance)[10]等均有促生作用。另有报道指出，土壤溶磷菌与其他生态功能菌如固氮菌的互作可显著提高溶磷效率，有利于植株苗高、地径、生物量等指标的增长[11]，说明溶磷菌与固氮菌的互作关系对植物具有增效促生作用。基于此，本研究将在山核桃根际土壤中分离获得3 种溶磷菌株和4 种固氮菌株，按不同比例配制成4 种复合菌剂，接种于山核桃根部土壤，通过测定山核桃幼苗生长和生理生化等指标，比较菌剂对山核桃幼苗的影响，筛选出对山核桃具有良好促生效果的菌剂，以期为山核桃的栽培提质增效和可持续经营提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验于2019年6月9日在浙江农林大学果木园(30°15′N，119°43′E)简易大棚内进行。选用浙江省杭州临安区山核桃试验地的根际土，筛选溶磷菌株和固氮菌株，制备混合菌剂；山核桃种子来源于果木园15年生的山核桃树，种子催芽播种后于温室大棚内培养，待幼苗生长半年后收获得到半年生山核桃幼苗45株。将幼苗移栽到大小为50 cm×40 cm×295 cm(外口直径×内口直径×高)的塑料花盆内(每盆3 株)，缓苗一个月后用于接种试验。所用土壤均为低磷土，有效磷含量为4.73 mg·kg－1，pH 值5.5。

1.2 试验设计

1.2.1 菌种分离与鉴定 称取10.0 g 山核桃根际土壤，分离纯化各菌株借鉴孙亚凯[12]的方法，再将纯化后的各菌株利用通用引物27F 和1492R 扩增16SrDNA序列，经与NCBI 数据库序列同源性比对确定其种属。同时，将菌株用甘油管保藏于超低温冰箱。

1.2.2 复合菌剂筛选与配制 将分离的溶磷菌株摇菌培养后，各取1 μL 菌液滴加在蒙金娜无磷培养基(Pikovskaya，PVK)上，28℃条件下培养3 d 后比较溶磷圈大小。选取3 株溶磷圈较大的溶磷菌株:果胶杆菌Pectobacterium cypripedii(R7)、伯克霍尔德氏菌Burkholderiasp.(R8)和肠杆菌Enterobactersp.(R9)与4 株自生固氮菌:解聚糖类芽孢杆菌Paenibacillus glycanilyticus(G2)、葡萄球菌Staphylococcussp.(G3)、假单胞菌Pseudomonassp.(G4)、芽孢杆菌Bacillussp.(G5)进行两两组合(12 组)，2 种菌株分别等量(1 μL∶1 μL＝v ∶v)滴加在PVK 平板同一处，培养3 d 后量取溶磷圈直径。试验重复3 次。选取溶磷圈直径最大的4 组菌剂进行溶磷量的定量分析。在5 mL PVK 液体培养基中各加入1 μL 的溶磷菌和固氮菌，28℃、125 r·min－1摇床培养5 d 后通过钼锑抗比色法定量分析组合菌剂的溶磷含量[13]。

采用韩华雯等[14]的方法，将各单菌于28℃、125 r·min－1摇床培养3～5 d，再用无菌水悬浮制成菌悬液(OD600＝0.5)，稀释涂板测定活菌量，确保每毫升活菌量≥2×108个。依据组合按1 ∶1的浓度制备4种混合菌剂:R7G5(果胶杆菌与副伯克霍尔德菌)、R8G4(伯克霍尔德氏菌与假单胞菌)、R8G5(伯克霍尔德氏菌与副伯克霍尔德菌)和R9G4(肠杆菌与假单胞菌)。

1.2.3 复合菌剂接种山核桃幼苗 2019年7月25日与8月25日进行2 次相同的接种试验，以定植山核桃幼苗根系菌种。在山核桃幼苗根系附近选取4 个注射点，每点注射复合菌剂7.5 mL。山核桃试验为4 种复合菌剂处理(R7G5、R8G4、R8G5、R9G4)和对照处理(CK，无菌水)，每个处理9 株苗。

1.3 测定项目与方法

分别于2019年7月25日(S1)、8月12日(S2)、8月30日(S3)、9月17日(S4)4 个时期测量生长指标，用卷尺和游标卡尺测定每株的苗长、地径。后三期(S2、S3、S4)测量完后，分别减去S1 期的测量值，得到增量变化。

2019年9月16日，利用LI－6800 光合仪(美国Li-COR 公司)测定不同处理下全部植株顶端第3 片成熟叶片的光合参数。2019年9月17日，取植株顶端第3 和第4 片成熟叶片，可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定[15]，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝染色法测定[16]，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量采用MDA测试盒(南京建成生物工程研究所有限公司)的TBA法测定。2019年9月18日，将植株连根取出、洗净，用EXPRESSION 1680 平板全彩影像扫描仪(Seiko Epson Corp，日本)进行根系图像扫描，采用WinRHIZO根系分析系统(Regent Instruments Inc.，加拿大)分析根系形态指标[17]；随后将整株植株于105℃杀青30 min、80℃烘干至恒重后测量干重[18]，并采用钼锑抗比色法测定植物全磷含量[13]。

1.4 数据分析

采用SPSS 17.0 软件分析数据，采用Excel 2007软件作表，运用Duncan’s 新复极差法进行多重比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 菌株分离与复合菌剂筛选

从山核桃林区土样中通过分离、纯化、筛选后，得到3 株溶磷细菌(R7、R8、R9)和4 株固氮菌(G2、G3、G4、G5)，后续将溶磷菌与固氮菌进行两两组合(表1)，根据溶磷圈直径选出相对高于CK 中单菌溶磷效果的菌剂组合(R7G5、R8G4、R8G5、R9G4)。通过钼锑抗比色法定量测定组合菌液中的溶磷量，其中R8G5、R9G4 组合的溶磷量显著高于R7G5、R8G4(图1)。

表1 不同复合菌剂的溶磷效果(溶磷圈直径mm)Table 1 The phosphate-dissolving effects (diameters，mm) of mixing microbial inoculums

2.2 复合菌剂处理对地径、苗长增量的影响

由图2 可知，5 个处理下山核桃幼苗的地径、苗长增量均随着生育期递进呈稳步上升趋势；每个时期各处理间总体无显著差异。S4 时期各处理增量达到最大值，苗长增量表现为R7G5(9.67 cm)>R8G4(8.72 cm)>R9G4(8.48 cm)>R8G5(8.06 cm)>CK(6.01 cm)；地径增量表现为R9G4、R8G5、R8G4、R7G5 较CK 分别增加了36.36%、21.21%、21.21%、6.06%。

2.3 复合菌剂处理对根系指标的影响

由表2 和图3 可知，复合菌剂处理山核桃幼苗的各项根系指标较CK 有明显促进效果，其中均以R8G5的促进效果最佳，根长、根表面积、根体积、总根投影面积、根尖数以及分支数较CK 分别显著增加了105.53%、 89.07%、 72.82%、 89.08%、 145.56% 与88.81%；另外，R8G5 的根长与根表面积均显著高于R8G4 与R9G4。

表2 复合菌剂处理对山核桃根系指标的影响Table 2 Effects of mixing microbial inoculums treatments on C. cathayensis root index

2.4 复合菌剂处理对植株生物量的影响

由表3 可知，复合菌剂处理对地上部、地下部及总生物量均有促进效果。其中R8G5、R7G5 的地下部和总生物量均较CK 显著增加，R8G5 分别增加了87.04%和52.94%，R7G5 分别增加了73.33% 和47.36%。

表3 复合菌剂处理对植株地上、地下部分以及总生物量的影响Table 3 Effects of mixing microbial inoculums treatments on aboveground and underground parts and biomass

2.5 复合菌剂处理对全磷含量的影响

由图4 可知，复合菌剂处理植株的全磷含量均显著高于CK，R9G4、R8G5、R8G4、R7G5 分别较CK 显著增加了58.16%、55.23%、46.28%、43.09%。

2.6 复合菌剂处理对光合参数指标的影响

由表4 可知，R9G4、R8G5 的净光合速率(net photosynthetic rate，Pn)较CK 分别显著增加79.47%和47.15%，且R9G4 的Pn 也显著高于R7G5 与R8G4。各复合菌剂处理的蒸腾速率(transpiration rate，Tr)、气孔导度(stomatal conductance，Gs)略高于CK、胞间CO2浓度(intercellular CO2concentration，Ci)略低于CK，均未达到显著差异。

表4 复合菌剂处理对山核桃光合指标的影响Table 4 Effects of mixing microbial inoculums treatments on the photosynthetic index of C. cathayensis

2.7 复合菌剂处理对可溶性糖、可溶性蛋白及丙二醛含量的影响

由图5 可知，4 种复合菌剂处理的可溶性糖含量均显著高于CK，其中R8G5、R7G5 较CK 显著增加91.99%与86.30%，且作用效果显著高于R8G4 与R9G4。4 种复合菌剂处理的可溶性蛋白含量均高于CK，其中R8G4 较CK 显著增加311.11%，同时也显著高于R8G5 与R9G4。4 种复合菌剂处理的MDA 含量均显著低于CK，且R7G5、R8G4 也显著低于R8G5 与R9G4。

3 讨论

磷是植物生长发育所必需的营养元素，参与大多数植物代谢过程，是限制产量的因素之一[19]。早期报道发现，在杨树和美国山核桃根际引入溶磷菌有利于提高土壤中微生物的活性、菌群多样性和土壤肥力，进而影响植株生长[20－21]。本试验中，4 组复合菌剂均促进了山核桃根系的生长发育，其中R8G5 的山核桃根长、根表面积、根体积均较CK 显著增加。这与Hameeda 等[8]和Gulden 等[22]通过施加溶磷菌促进植物根长等指标显著增加的研究结果相似。这可能是由于溶磷菌与根际菌群及根系分泌物相互作用，进而改变了根际的营养结构，促进了根系的生长[23]。另外，本研究中复合菌剂处理组的地径、株高与CK 无明显差异，这可能与试验周期短于木本植物生长周期有关。

Samina 等[24]发现根际溶磷菌可显著增加植株含磷量和产量；余旋等[20]发现接种溶磷菌处理的薄壳山核桃均表现出较高的Pn；薛应钰等[25]研究发现接种溶磷木霉菌可显著增加番茄的生物量。本研究结果与之相似，4 组复合菌剂处理对山核桃磷素的吸收与储存能力、Pn 以及总生物量均有提升作用，其中R8G5的3 项指标较CK 分别显著增加了55.23%、47.15%与52.94%。这可能是由于菌剂处理可促进根系的生长，提高山核桃对于磷素的吸收与储存，进而加快促进光合作用，增加山核桃的生物量。同时本研究发现，接种后山核桃幼苗可溶性糖含量显著增加，可溶性蛋白含量明显增加，MDA 含量显著减少。这3 个指标的变化表明复合菌剂有利于山核桃幼苗生长，其内在原因可能是接种菌剂后改善了植物所处的胁迫环境，从而减少植物所需能耗，进而引起体内可溶性糖和蛋白等含量上升，使得MDA 含量随之下降，进而提高植物的适生性[26－27]，但复合菌剂－磷素－土壤－山核桃植株四者间的转化机制有待进一步研究。

有研究报道，溶磷菌能够通过NH4＋同化作用释放质子或通过呼吸作用释放CO2，进而降低土壤pH 值，促进了难溶性磷酸盐溶解[28]，或者通过增加植物根系吸收磷的面积、增加磷酸酶的活性，促进植株对磷的吸收[29]。而溶磷菌与固氮菌互作更能提升溶磷菌释放磷的效果。从本研究前期菌种培养的溶磷效果分析可知，复合菌剂总体优于单菌，这可能与不同功能菌之间的互惠生态关系有关。这与李玫等[11]研究发现与单一菌接种相比，在红海榄上接种复合菌剂，更能有效地促进植株的生长及营养状况相似。而冯瑞章等[30]研究也表明固氮菌与溶磷菌互作会影响土壤中有机酸含量和pH 值的变化，进而促进植株各项指标。这与本研究发现溶磷菌通过与固氮菌的相互作用，能够促进溶磷功效，进而提升山核桃的生理活性相似。

本研究中，不同复合菌剂对山核桃的促生作用也有所差异，其中R8G5 对山核桃幼苗的根系发育、总生物量和可溶性糖含量的提升效果最佳，而R9G4 对Pn和植株全磷含量的提升效果更好。促生效果各有不同，可能是由于功能菌对植物的作用各有特点，也可能与不同菌株组合在植物根系定殖能力的差异以及特定根系菌群互作有关。可见，不同菌种之间的互作及其定殖能力是菌肥施用不可忽视的重要条件。

4 结论

本研究从山核桃林区根际土壤中分离、纯化并鉴定出3 株溶磷细菌(果胶杆菌R7、伯克霍尔德氏菌R8和肠杆菌R9)和4 株固氮菌(解聚糖类芽孢杆菌G2，葡萄球菌G3，假单胞菌G4 和芽孢杆菌G5)，分别组成4 种复合菌剂，不同复合菌剂均促进了山核桃根系的生长发育，提高了山核桃对磷素的吸收与储存，并促进了其叶片的光合作用，从而增加了山核桃的生物量。其中复合菌剂R8G5(伯克霍尔德氏菌与芽孢杆菌组合)对山核桃幼苗总体的促生效果最佳，能显著增加根长、Pn、可溶性蛋白含量、总生物量等多项指标，并且能增强山核桃植株的抗逆性。但复合菌剂如何诱导植物根系发育和促进磷素吸收的内在机制还需要进一步研究。