黄芩提取物对人体肠道菌群及短链脂肪酸的影响

刘世锋 罗玉霜 刘佩琳 康信聪 王蕾伍 睿宇 刘东波

摘 要：目的：通过人体肠道微生物生态模拟系统（SHIME），探究黄芩提取物对人体肠道菌群中的厌氧菌菌群丰度和短链脂肪酸（SCFA）的影响。方法：采用体外模拟系统模拟人体肠道微生态。大肠模拟罐中接种人体粪便样本，待粪便中的微生物维持稳定后，添加黄芩提取物（3.2 g/d）连续干预7 d，使用平板计数法分析模拟系统中的总厌氧菌及乳酸菌的菌群丰度变化，分别使用脑心浸液培养基（BHI）、MRS培养基（MRS）接种菌液，并在厌氧箱中倒置培养48 h。使用气相色谱分析黄芩提取物干预前后的肠道菌群代谢产物SCFA（乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、异己酸和己酸）的含量变化。结果：与第6天取样结果相比，第14天的取样结果黄芩提取物增加了乳酸菌在内的厌氧菌菌群丰度。SCFA中的丁酸含量显著上升（P<0.01），而异戊酸含量显著下降（P<0.01）。乙酸没有显著差异。结论：黄芩提取物可能通过改善乳酸菌及总厌氧菌的菌群丰度，提高丁酸含量，达到治疗肠道疾病的功效，为中草药黄芩提取物的体内研究奠定基础。

关键词：人体微生物生态系统模拟器;黄芩提取物;肠道菌群;短链脂肪酸

肠道菌群与宿主相互依存、共同进化，在维持机体免疫和代谢稳态以及抵御病原体方面发挥着至关重要的作用[1]。肠道菌群组成的改变（生态失调）与肥胖、糖尿病以及心脑血管等疾病的发生密切相关[2]。短链脂肪酸（SCFA）是人体肠道菌群代谢的主要终产物，主要由厌氧微生物发酵难消化的碳水化合物产生。SCFA包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、异己酸和己酸等，其中乙酸、丙酸、丁酸占比最高，达到总SCFA的90%以上。SCFA可以降低结肠内 pH 值，提高其酸性环境从而抑制有害菌的生长;维持水电解质平衡[3];抑制组蛋白去乙酰化酶和激活G蛋白偶联受体GPR41、GPR43和GPR109α[4]，调节肠道、神经、内分泌和血液等不同系统的功能，成为调节代谢紊乱和免疫的关键因子。另外，SCFA还可以通过激活核转录因子-κB（NF-κB）来抑制细胞因子的产生（如IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α）[5]从而减少炎症反应的发生;炎症过程中，SCFA通过激活GPR43[6]，调节中性粒细胞产生活性氧和吞噬作用来刺激中性粒细胞迁移[7]，从而促进粘膜炎症的修复，降低结肠病变的发生。因此，越来越多的证据支持SCFA在形成局部和外周免疫系统中发挥了关键作用，并通过炎症途径影响宿主的代谢。

现代药理学研究发现，黄芩具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗抑郁等作用[8]。刘晓曦等[9]研究发现，黄芩水提液可以缓解肠炎小鼠的炎症反应来促进肠道的损伤修复。然而，目前针对人体肠道菌群的干预研究尚欠缺。人体肠道微生物生态模拟系统（SHIME ），是由比利时根特大学Verstraete研制出来的一套包含胃、小肠以及大肠的完整模拟消化系统。SHIME系统的设计着重于模拟结肠微生物群落，因其稳定性好、采集样品方便、节省时间等优点，是研究体外胃肠道不同部位营养对肠道菌群组成影响的有效工具[10]。本研究应用SHIME模拟人体胃肠道系统，通过使用黄芩提取物对模拟肠道微生态进行干预，对系统产出的消化液进行检测与分析，分析黄芩水提物对肠道菌群及其代谢产物SCFA的影响，探究黄芩对预防与治疗肠道炎症的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 LABOROTA 4001旋转蒸发仪，德国Heidolph公司;XS205十万分之一分析天平，德国METTLER TOLEDO公司;PL403分析天平，METTLER TOLEDO;LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂;双列六孔水浴锅、DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司;冰箱，海尔;KQ-52008超声波清洗器，昆山美美超声仪器有限公司;SHIME系统，北京佳德精密科技有限公司;YQX-II型厌氧培养箱，金坛区白塔安瑞实验仪器厂;SW-CJ-2F型双人双面净化工作台，苏州净化设备有限公司;PYX-300G-B光照培养箱、QL-901 Vortex涡混仪，海门市其林贝尔仪器制造有限公司;2-16R高速冷冻离心机，湖南恒诺仪器设备有限公司;GC-2010气相色谱仪，日本岛津公司;RE-52A旋转蒸发器，上海雅荣生化仪器设备有限公司。

1.1.2 试剂 黄芩，购自九芝堂股份有限公司长沙店;阿拉伯半乳聚糖、木聚糖、淀粉、葡萄糖、碳酸氢钠、酵母提取物、蛋白胨、半胱氨酸、吐温80、氯化钠、果胶、一水硫酸锰、七水硫酸铁、七水硫酸钴、七水硫酸锌、五水硫酸铜、磷酸氢二钾、氯化钙、七水硫酸镁、血红素、对-氨基苯甲酸、氯化钠、胃蛋白酶、36.5%浓盐酸、氢氧化钠、胰蛋白酶、硫酸铝钾、硼酸、钼酸钠、氯化镍、亚硒酸钠、生物素、泛酸盐、烟酰胺、维生素B12、硫胺、甲萘醌、猪胆盐、碳酸氢钠、PBS固体粉末、无菌蒸馏水。

标准品：乙酸、丙酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸、己酸、2-乙基丁酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;正丁酸，上海源叶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黄芩的处理 称量85 g黄芩，以10倍量的沸水提取1.5 h，分离料液与残渣，残渣再以8倍量的沸水继续提取1 h，合并料液，减压浓缩，再冷冻干燥，得黄芩提取物冻干样品 28.45 g。

1.2.2 模拟消化方法 系统模拟实验方法包括系统时间、速度及其他参数设定，粪便接种液制备，肠道微生态的增殖和稳定，胃和小肠消化液、营养液制备，以及模拟消化步骤均借鉴于暨南大学邵鑫[11]的试验方法。為使系统内菌群增殖并达到稳定状态，设定周期内的第1～6天为稳定期，稳定期内每日9∶00、15∶00、21∶00 给予260 mL混合营养液。第7～14天为加入黄芩提取物的干预期，干预期内9∶00的喂料需混入3.2 g黄芩提取物冻干粉，其余操作均与稳定期相同。

1.2.3 菌种的培养计数 每天第1次喂食前对大肠消化液取样，取样的样品分别存放于4 ℃和-80 ℃冰箱。消化液中菌群丰度采用平板菌落计数法进行菌群数量的测定，分析总厌氧菌、乳酸菌群落数量的变化。（1）菌种的培养：分别取同一天存储于4 ℃冰箱的大肠消化液样品1 mL，用无菌PBS缓冲液进行梯度稀释。总厌氧菌、乳酸菌的每个稀释度分别涂布3个平板，每皿1 mL稀释样品，分别做好标记。接种结束后及时分别将15～20 mL BHI、MRS琼脂培养基倾注到相应标记的每个平板中。其中，总厌氧菌采用BHI琼脂培养基计数，乳酸菌采用MRS琼脂培养基计数，将总厌氧菌、乳酸菌转移到厌氧培养箱中倒置培养（48±2）h。（2）菌种的计数：培养（48±2）h后，计数每个平板上的菌落数，计数时选取菌落数在30～300 之间的平板（SN标准要求为25～250个菌落），若有二个稀释度均在30～300 之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值≤2取平均数，比值>2则取其较小数字。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算出原始样品每毫升中的菌落数。到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0～4 ℃处储存，但不得超过24 h。

1.2.4 GC检测SCFA （1）GC分析条件：DB-FATWAX UI（30 m×0.250 mm×0.25 μm）毛细管色谱柱，载气为高纯氮气，柱流量1.5 mL/min，升温程序为：初始温度70 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升至160 ℃，保持6 min，再以30 ℃/min升至210 ℃，保持5 min;进样口温度250 ℃，检测器温度250 ℃，分流比19∶1，进样量0.5 μL。（2）标准品溶液制备：对8个SCFA混合标准溶液的制备，称量乙酸20.9 mg、丙酸20.5 mg、异丁酸9.9 mg、丁酸12.0 mg、异戊酸9.5 mg、戊酸9.2 mg、己酸9.0 mg、2-乙基丁酸9.6 mg，并用含有1%甲酸水定容至10 mL，制成混合标准品母液，分别移取该母液稀释1、2、5、10、100、500、100倍，配制成不同浓度的混标，用一次性0.45 μm水膜过膜后，在4 ℃冰箱存放备用。（3）样品溶液制备：取稳定期、干预期最后一天的大肠消化液2 mL至离心管中，加入1%甲酸水，涡混仪上混匀30 s，加入内标2-乙基丁酸1 μL，混匀1 min，再以8 000 r/min离心10 min，移取上清液过0.45 μm水膜进行气相色谱分析。

2 结果与分析

2.1 黄芩提取物对肠道菌群丰度的影响

2.1.1 总厌氧菌数量变化 总厌氧菌数量在前6天的稳定期内出现波动，但整体仍维持相对稳定，从第7天开始进入干预期后，总厌氧菌的数量明显上升，从第9天开始总厌氧菌的数量基本保持稳定，数量约为109.03～109.07CFU（图1）。

2.1.2 乳酸菌的数量变化 稳定期内，乳酸菌的数量在前3天显著上升后维持基本稳定，从第7天进入干预期开始，乳酸菌的数量增至最大，并在维持期内基本保持稳定，数量约为106.78～106.90CFU（图2）。

3 短链脂肪酸含量变化分析

取SHIME运行周期中稳定期、干预期最后一天的大肠消化液，对其中的7种SCFA（乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸、己酸）含量进行检测分析。如图3所示，消化液中的SCFA以乙酸、丙酸、丁酸为主，占总含量的96.76%。经黄芩提取物干预后，大肠中的丁酸含量上升了650.57%，为0.48 mg/mL;异戊酸含量下降了84.60%，为0.004 mg/mL;其余组分含量的变化不呈现显著性差异。

4 讨论

SHIME系统是基于人体体内消化环境而建立起的人体体外消化模型，可预测食物、药物在人体内的消化代谢，研究和理解营养物质、药物和非营养化合物的变化、相互作用以及生物可及性[12]。本研究参考邵鑫[11]的试验方法，建立胃肠道消化模拟系统，并参照《药典》记录的黄芩推荐单日摄入量，给予系统等当量的黄芩提取物进行混合干预，旨在探究黄芩提取物对人体胃肠道消化系统中厌氧菌及菌群产物-短链脂肪酸的影响。

本研究结果表明，黄芩提取物增加了大肠发酵罐中总厌氧菌及乳酸菌的丰度，并促进了丁酸的产生。厌氧菌包含了普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）、直肠真杆菌（Eubacterium rectale）、霍氏真杆菌（Eubacterium hallii）、布氏瘤胃球菌（Ruminococcus bromii）等菌属，这些菌属可产生大部分的丁酸[13]。丁酸盐不仅可以抑制NF-κB，激活巨噬细胞，而且能够抑制组蛋白去乙酰化酶活性（HDAC）[14]，产生抗炎作用。乳酸菌是肠道内不同于革兰氏阳性菌的一类细菌的统称，乳酸菌可以通过分泌各种代谢产物及细菌素抑制肠内腐败菌的生长，或与肠内致病菌群竞争消化道附着位点和营养等从而维持肠内的菌群微生态平衡[15]。本研究发现，黄芩提取物干预后乳酸菌丰度显著上升。因此，黄芩常用于治疗肠道疾病可能与其增加大肠内乳酸菌、丁酸产生菌的丰度，以及提高丁酸含量有关。

蛋白质发酵可产生支链脂肪酸，如分别来自于支链氨基酸缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的异丁酸、2-甲基丁酸和异戊酸酯[16]。异戊酸可以通过抑制Na+/K+-ATPase9（一种维持正常神经传递所必需的基础电位膜的关键酶）[17]，减少AMPA受体中GluR2亚基的比例，进而减少Na+流入，最终导致抑郁癥的发生。有研究发现，黄芩苷能通过影响AMPA受体的表达，起到抗抑郁的作用[18];前期试验表明，黄芩苷是黄芩提取物中的主要成分，在本试验干预期内异戊酸产出量显著降低，推测黄芩提取物可能通过抑制异戊酸的合成，进而上调AMPA受体的表达，发挥其抗抑郁作用。

本研究建立了黃芩提取物-肠道菌群-丁酸功能轴，从肠道微生物及代谢产物的角度阐述了中药黄芩干预肠道生态的基本机制。未来本课题组将使用糖尿病人的肠道菌群进行下一步试验，本研究为进一步开展黄芩提取物的人群试验奠定基础。

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