藜豆提取物左旋多巴对黑色素细胞的作用

郝益 孙铭健 边策 高原 庄肖肖 王宏兰

摘要：目的 研究藜豆提取物左旋多巴对体外培养的黑色素细胞双向调节作用。方法 在体外原代培养小鼠黑色素细胞后传代培养，用不同浓度藜豆提取物左旋多巴97.31mg/ml、146.02mg/mL、175.23mg/mL作用于黑色素细胞，观察黑色素细胞增殖情况。结果 1. 4代空白组与对不同浓度对照组（97.31mg/mL、146.02mg/mL、175.23mg/mL）相比对小鼠黑色素细胞的合成并无显著影响（P>0.05）。5代空白组与不同浓度对照组（97.31mg/mL、146.02mg/mL、175.23mg/mL）相比显著促进小鼠黑色素细胞的合成量（P<0.05）。2. 4代黑色素细胞随着给药浓度的增大凋亡率逐渐增加，当药物浓度为146.02mg/mL作用于黑色素细胞5代时，发现药物具有促进黑色素细胞生长的作用。当药物浓度为97.31mg/mL、175.23mg/mL作用于黑色素细胞5代时，发现药物具有显著抑制黑色素细胞生长的作用。结论 1. 适当浓度（146.02mg/mL）的藜豆提取物左旋多巴能够促进黑色素细胞的增殖。2. 浓度为97.31mg/mL、175.23mg/mL藜豆提取物左旋多巴抑制黑色素细胞的生长。

关键词：黑色素细胞;藜豆;左旋多巴;细胞培养

藜豆（S.capitatum Kuntze）为豆科藜豆属中以嫩荚及种子供食用的栽培种群，属一年生缠绕性草本植物，别名虎豆、狗爪豆等。实验结果表明藜豆提取物富含左旋多巴。[1]左旋多巴是黑质纹状体多巴胺以及皮肤细胞黑色素合成的底物，被广泛地用于治疗人类的帕金森病，而且在離体条件下，还选择性地抑制人类黑色素瘤（Melanoma）色素细胞的生长。[2]

本实验基于黑色素细胞培养体系探索藜豆提取物左旋多巴对于黑色素细胞的作用，笔者建立了体外藜豆提取物左旋多巴对于黑色素细胞作用的药物模型，采用不同浓度藜豆提取物左旋多巴作用于黑色素细胞来观察其对黑色素生物活性的影响。

1.藜豆对黑色素细胞的药理作用

1.1黑色素细胞合成过程 酪氨酸在酪氨酸酶催化作用下生成多巴继而氧化为多巴醌，多巴醌发生多聚化反应而形成无色的多巴素。在异构酶的作用下，多巴素形成真黑色素。【3-4】

1.2藜豆的药理作用 藜豆的主要成分为左旋多巴，左旋多巴为体内合成多巴胺的前体物，经血脑屏障进入中枢，经多巴脱羧酶作用转化多巴胺。[5]此外，藜豆及其变种在治疗男性不育症、降血糖、抗蛇毒等其他方面的药理作用及其机制也是研究重点，相关的氨基酸、生物碱、多酚、蛋白质等活性成分正在被逐步揭示。鉴于我国具有丰富的药用植物资源，藜豆及其变种对于上述疾病的药理作用等方面的深入研究和资源开发利用仍有待进一步重视和加强。[6]

1.3藜豆提取物左旋多巴对黑色素细胞的药理作用 藜豆提取物左旋多巴，最终合成多巴胺，多巴胺在体内氧化成多巴醌，多巴醌进入真黑素通路形成真黑素。[7]从而通过这一巧妙的方式，无需酪氨酸和多巴的参与形成黑色素。适用于酪氨酸缺乏患者，增强黑色素的形成.[8]

2.实验材料与方法

2.1主要试剂及仪器 藜豆提取物（植提专家公司）;;胰蛋白酶（索莱宝公司）;DMEM（Hyclone公司）;新生牛血清（四季青公司）;中性蛋白酶（奥博星公司）;F12培养液（biosharp公司）;RPMI1640（biosharp公司）;中性蛋白酶（coolaber公司）;台盼蓝染色液（biosharp公司）;倒置显微镜（齐齐哈尔医学院提供）。

2.2实验方法

2.2.1藜豆提取物的制备（植提专家公司提供） 将藜豆粉碎为80目细粉，用30%乙醇 0.1%醋酸水溶液冷浸三次，每次20小时后过滤，减压浓缩至豆粉的三倍。薄膜蒸发浓缩至析出左旋多巴，冷置24小时，过滤，用冷水洗涤制得粗品。将粗品用24倍量纯水，10%活性炭重结晶，40℃鼓风干燥制得藜豆提取物[9]。

2.2.2样品液的配置 称取藜豆提取物7.5g，溶于10mL 3%冰醋酸，加30mL 75%乙醇，用200目过滤网过滤再用10mL乙醇清洗过滤网。将滤液用蒸馏水稀释到500mL，取5mL样品，再次使用蒸馏水稀释到500mL。

2.2.3紫外分光光度计测定方法及结果 分别取适量配好样本液，在紫外波长280nm的范围内测量吸光值，并在标准品左旋多巴浓度图上找出相应浓度并计算含量。测量的吸光值为0.175，据计算测得藜豆提取物左旋多巴为8.56%。

2.2.3体外给药细胞模型的建立 3g藜豆提取物与120mL黑色素培养基搅匀，配为25mg/mL藜豆提取物混合液。在细胞传代第三代时，设立1、2、3号板作为空白对照组（对应标为4、5、6号板），7号板加入黑色素培养基与0.22微米过滤后的藜豆提取物混合液2：1（97.31mg/mL藜豆提取物混合液），8号板加入培养基：药物1：1（146.02mg/mL藜豆提取物混合液），9号板加入培养基2：3（175.23mg/mL藜豆提取物混合液）。加药后培养48h，继续培养7、8、9代细胞，观察黑色素细胞数量变化。[10]

3.黑素细胞体外培养

3.1黑色素细胞培养基的配置 胎牛血清90mL，DMEM/F12培养基450mL，DMEM高糖培养基360mL，双抗1mL，碱性成纤维细胞生长因子2g，加入碳酸氢钠调PH到7.2-7.4，0.22um滤器过滤，分装成12mL/瓶，做好标记，封口，4℃冷藏。

3.2黑色素细胞原代培养 取4只小鼠颈椎脱位法处死，用肥皂水和11号手术刀刀片小心将小鼠背部毛发刮除，用眼科剪和眼科镊分别将4只小鼠背部皮肤取下。去除皮下组织，酒精浸泡2min再用含双抗的PBS液（含青霉素、链霉素1mL/L）浸泡10min。用11号手术刀刀片将皮切成2-3 mm宽的皮条。放入到0.25%的Dispase I酶中，4℃消化20-24h。在超净工作台内用眼科镊、眼科剪将皮条的表皮、真皮分离，将分离出来的表皮剪碎，加入0.25%的胰蛋白酶，放入37℃水浴锅内消化10 min。加入等量的终止液终止胰蛋白酶的消化后用吸管吹打混合均匀。分别放入4个离心管中离心机1000 rpm离心10 min弃去上清。4支离心管加入DMEM培养基重悬，平均放入4个6孔培养板中，分别标记为原代1板、2板、3板、4板，加入黑色素细胞专用培养基，封口膜封口放入37℃培养箱中培养，3d后换液进行传代。[7]

3.3 黑素细胞传代培养 倒置显微镜下观察黑色素细胞生长情况，培养板中细胞差不多铺满培养板时，吸去培养基。每孔加入1 mL的0.25%胰蛋白酶，盖好培养板，十字摇晃，放入培养箱中37℃消化8 min、18min、28min，随时观察细胞消化情况。消化完成后，加入等量的终止液终止消化。用吸管反复吹打分别放入离心管中，离心机1000rpm离心10min。弃去上清液，每孔加入2mL的黑色素细胞专用培养基，重悬后吸取进行细胞计数，按照10^5細胞浓度将每个板重新接种到2个新的6孔细胞培养板中，封口膜封口、标记，放入37℃培养箱中培养。

3.4统计学方法 采用SPSS21.0统计软件进行分析处理，采用配对t检验分析，P<0.05为差异具有显著性。

4.实验结果

4.1实验数据 小鼠黑色素细胞传代后进行每一代每号板mei4孔的观察。在第二代1号板平均细胞数为432、2号板平均细胞数为597，3号板平均细胞数为658;在第三代培养时，细胞1号板平均细胞数为264、2号板平均细胞数为674，3号板平均细胞数为271，见表1。于第三代细胞给予干预处理，对照组加入同体积培养液，实验组设立不同药物浓度梯度（97.31mg/mL、146.02mg/mL、175.23mg/mL）。在第四代1号板（记为4号板）平均细胞数为234、2号板（记为5号板）平均细胞数为583，3号板（记为6号板）平均细胞数为264，97.31mg/mL藜豆提取物混合液的7号板平均细胞数为264、146.02mg/mL藜豆提取物混合液8号板平均细胞数为355， 175.23mg/mL藜豆提取物混合液9号板平均细胞数为47;在第五代1号板（记为4号板）平均细胞数为173、2号板（记为5号板）平均细胞数为251，3号板（记为6号板）平均细胞数为112，97.31mg/mL藜豆提取物混合液的7号板平均细胞数为0、146.02mg/mL藜豆提取物混合液8号板平均细胞数为421， 175.23mg/mL藜豆提取物混合液9号板平均细胞数为0，见表2。

在97.31mg/mL，146.02mg/mL，175.23mg/mL不同药物浓度下，随着药物浓度的不断增大，4代黑色素细胞凋亡率不断上升。当细胞培养到第5代时，低浓度和高浓度药物作用下，均出现了细胞损伤，相反，中浓度药物作用下，黑色素细胞凋亡率较上一代有所减少，表现出药物在适宜浓度下对黑色素细胞的促进作用。

第四代细胞培养中，空白组配对低、中、高药物浓度组均未显示出统计学差异（P>0.05）。第五代细胞培养中，空白组配对低、中、高药物浓度组均显示出统计学差异（P<0.05）。综合数据可知，其中，低、高浓度组药物（97.31mg/mL、175.23mg/mL），表现出对黑色素细胞的抑制作用，而中浓度组药物（146.02mg/mL）则表现出对黑色素细胞的促进生长的作用。

5.结论

4代空白组与对不同浓度对照组统计学相比均无明显差异。5代空白组与不同浓度对照组（97.31mg/mL、146.02mg/mL、175.23mg/mL）相比均具有统计学差异（P<0.05）。4代黑色素细胞随着给药浓度的增大凋亡率逐渐增加，当药物浓度为146.02mg/mL作用于黑色素细胞5代时，发现药物具有促进黑色素细胞生长的作用。当药物浓度为97.31mg/mL、175.23mg/mL作用于黑色素细胞5代时，发现药物具有显著抑制黑色素细胞生长的作用。

6.分析与讨论

黑色素是由3，4-二羟苯丙氨酸或酪氨酸经过系列反应形成，在动物体内，黑色素是一种存在于皮肤、毛发的黑褐色的色素，合成并存储于黑素细胞中。黑色素能对抗紫外线，它能够将绝大多数的紫外线转换为热量散失，避免紫外线对深层细胞造成损伤。因此，皮肤才能够保持正常的色度。当黑色素合成减少，皮肤就会造成色素缺失，形成白斑，会产生一些疾病，例如白癜风、白化症等。

各种色素缺失性皮肤病，是以皮肤局部功能性黑素细胞缺失为主要病理性特征的一类难治性皮肤病，目前尚无满意的临床治疗方案。在正常生理状态下，黑色素和合成与代谢处于动态平衡中。酪氨酸酶与血液中的酪氨酸发生反应，生成黑色素前体物质“多巴”，多巴经系列氧化还原反应可以生成黑色素。本实验采用藜豆提取物左旋多巴作用于黑素细胞，探究药物对黑色素细胞的双向调节作用[11]。

本文验证了低、高浓度组藜豆提取物左旋多巴药物（97.31mg/mL、175.23mg/mL），表现出对黑色素细胞的抑制作用，而中浓度组药物（146.02mg/mL）则表现出对黑色素细胞的促进生长的作用。其机制可能为;第一，药物促进DNA损伤组织中细胞凋亡，而中等浓度下药物促进未凋亡细胞快速增殖;第二，藜豆提取物左旋多巴作用于细胞后，负反馈调节抑制酪氨酸酶活性，只有在中等浓度下对黑色素细胞的增殖作用大于酪氨酸酶活性减低影响;第三，藜豆提取物左旋多巴可能参与信号通路参与或调控了某一成分对黑色素合成的抑制作用，而在中等药物浓度下此作用被翻转;其四，需进一步明确黑色素其他调控机制，如促进黑色素分解及代谢，调控酪氨酸酶翻译后的修饰，抑制角质形成细胞对黑素小体的摄取和吞噬等，藜豆提取物左旋多巴对黑色素细胞的作用可能受到以上几个方面的共同作用。[12]

而在临床上常常使用左旋多巴来治疗帕金森患者，有证据表明这些患者患黑色素瘤的几率却大大增加。我们希望可以通过此次实验探究出藜豆提取物左旋多巴与黑色素细胞是否有着直接或间接的联系，以此来进一步探讨临床上是否可以使用这种药物来影响患者的黑色素细胞含量。现阶段的藜豆及其变种的研究还处于药效学验证阶段，除了对黑色素的作用外，藜豆对防治帕金森、男性不育症的治疗等疾病积极作用仍是有利的。虽然其成分的具体药理作用还有待进一步的研究与发现，但如果我们能找到既能有效治疗帕金森，又能最大程度上减少患黑色素瘤的几率时的左旋多巴使用量，那对临床上左旋多巴相关药物应用等方面开辟了更新更广的前景。

综上所述，藜豆提取物左旋多巴在适当浓度146.02mg/mL能够促进黑色素细胞的增殖。浓度为97.31mg/mL、175.23mg/mL藜豆提取物左旋多巴抑制黑色素细胞的生长。因此，藜豆提取物左旋多巴对黑色素细胞具有双向调节的作用。我们将会在接下来的实验中，设立更加精确的给药梯度以更深入地探究藜豆提取物左旋多巴促进黑色素细胞增殖的给药范围。同时，有关黑色素相关检测的一些实验学方法如氢氧化钠裂解法、比色法定量检测、Masson-Fontana氏黑色素染色法等也仍需在后续实验中补充。

此外，关于藜豆提取物左旋多巴对小鼠黑色素细胞的作用机制尚未探索，希望在之后的实验中能明确于黑色素细胞密切相关酶mRNA、DNA表达水平，使得藜豆提取物左旋多巴在医疗领域的应用更加广泛。[13]

参考文献：

[1]Liu Shuyuan，Zhang Qiqi，Guan Changfei，Wu Daying，Zhou Tianshan，Yu Youben. Transcription factor WRKY14 mediates resistance of tea plants （Camellia sinensis （L.） O. Kuntze） to blister blight[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology，2021（prepublish）.

[2]潘鹏伟，王雪晶，丁雪冰，何一昕，梁东晓，方艳博，刘丹丹，滕军放，苗旺.帕金森病与癌症发病相关机制研究进展[J].中国实用神经疾病杂志，2016，19（06）：123-125.

[3]马梓育，陆洋.体内黑色素合成、调控及常用天然、中药来源的黑色素抑制劑[J].中国中药杂志，2020，45（24）：5898-5916.

[4]王磊，刘军.黑色素形成分子机制研究进展[J].新疆大学学报（自然科学版），2019，36（04）：468-474+499.

[5]邓霖芳，谭蓓蓓，窦冕，郝丽莉，刘江云，杨世林.HPLC同时测定猫豆中左旋多巴及其衍生物含量[J].中国现代应用药学，2016，33（07）：845-848.

[6]温红，谭蓓蓓，窦冕，邓霖芳，单佳晶，李君山，刘江云.藜豆及其变种的药理作用研究进展[J].中国药房，2018，29（04）：568-571.

[7]Roy Swarup，Rhim Jong-Whan. Fabrication of pectin/agar blended functional film： Effect of reinforcement of melanin nanoparticles and grapefruit seed extract[J]. Food Hydrocolloids，2021，118.

[8]罗晓君，蒋咏梅，章文贤.黑色素的生成机制、相关疾病及抑制策略概述[J].生物学教学，2021，46（02）：5-7.

[9]温红，谭蓓蓓，窦冕，邓霖芳，单佳晶，李君山，刘江云.藜豆及其变种的药理作用研究进展[J].中国药房，2018，29（04）：568-571.

[10]石占全. 小鼠黑色素细胞体外分离培养及生物学特性研究[D].山西农业大学，2015.

[11]李士侠. 牛樟芝提取物对黑素细胞的影响[D].齐鲁工业大学，2017.

[12]王蔚，陈琳，王伟伟，张建勇，江和源.茶叶有效成分对黑色素形成的抑制作用[J].茶叶科学，2021，41（01）：7-18.

[13]刘玉荣，曹雅菲，雒洋洋，高怡，刘景源，刘君星.丁香精油对黑色素细胞抗氧化特性及黑色素生成的影响[J].黑龙江医药科学，2021，44（01）：48-49+52.

大学生创新创业项目《藜豆提取物左旋多巴对黑色素细胞的作用》（202011230065）