欧亚旋覆花总黄酮对肢体缺血再灌注骨骼肌影响的研究

杨盺宇

【摘要】目的：探讨欧亚旋覆花总黄酮（total flavones extracted from Inula britannica L，TFIB）对肢体缺血再灌注骨骼肌的保护作用。方法：健康成年家兔20只，随机分为对照组和实验组，每组10只，建立兔肢体缺血再灌注损伤动物模型。在即将恢复血流灌注时，两组分别自耳缘静脉注射生理盐水（对照组）、欧亚旋覆花总黄酮注射液（实验组）。分别在缺血前、缺血后2h、再灌注后1h、再灌注后3h采集术侧股静脉血样。测定血清乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）的含量。取上述各时相点动物胫前肌组织，测定骨骼肌组织湿/干重比值并观察肌组织微细和超微结构变化。结果：实验组再灌注后LDH、CK明显低于对照组（P<0.01），骨骼肌组织湿/干重比值低于同期对照组（P<0.05）。光镜及电镜下观察实验组骨骼机损伤轻于对照组。结论：欧亚旋覆花总黄酮能够缓解组织水肿，保护缺血再灌注骨骼机。

【关键词】欧亚旋覆花总黄酮;骨骼肌;再灌注损伤

【中图分类号】R681;【文献标识码】A; 【文章编号】2026-5328（2021）02-025-05

Abstract：Objective：To study the protective effect and mechanism of Total flavones extracted from Inula britannica L （TFIB）on ischemia reperfusion injury of skeletal muscle. Methods：The experimental model of ischemia reperfusion injury in extremity were produced in 20 healthy adult rabbits which were randomly divided

into experimental and control groups（each of 10 rabbits）. Normal saline injection and TFIB were infused intravenously into rabbits of control group，experimental group respectively just before blood reperfusion. At preischemia，2 hours post-ischemia，1 hour post-reperfusion and 3 hours post-reperfusion，sample of blood was collected from the femoral veins respectively for measurements of lactic dehydrogenase（LDH），creatine kinase（CK） by means of biochemical methods in every rabbit. Meanwhile the tibialis anterior muscles were harvested for the measurements of Wet/Dry ratio of skeletal muscle and for the microscope and ultrastructure examinations by using optical microscope and electronic microscope respectively . Results ：After reperfusion，the contents of LDH、CK were dramatically higher in control group（P<0.01） but were not in experimental group（P>0.05）. The Wet/Dry ratio of skeletal muscle had not obvious difference in every group（P>0.05） before reperfusioin. The skeletal muscle injury of experimental groups，after reperfusion was of a mild degree than of control group in light microscope and electronic microscope examinations. Conclusion：TFIB can effectively improve soft tissue swelling and protec skeletal muscle from ischemia reperfusion injury.

Key words：Total flavones extracted from Inula britannica L;Skeletal muscle; Reperfusion injury

肢体的创伤、断肢再植、血栓形成、组织移植以及止血带的应用时间过长均可引起肢体缺血。随着血流的恢复，在随后的一段时间内组织损伤不仅不减轻反而逐渐加重，这种现象称为肢体缺血再灌注损伤。它不仅影响缺血肢体组织的存活及功能，而且可累及全身多器官，严重时可引发多器官功能衰竭而导致患者死亡[1，2]。欧亚旋覆花是菊科旋覆花属，多年生草本植物，性味咸、温;入肺、肾经。其黄酮类物质的含量高达10.9%，黄酮类化合物具有清除自由基和抗应激反应的能力。欧亚旋覆花含有槲皮素、木犀草素、槲皮苷等多种黄酮类化合物，具有抗氧化活性[3，4]。有报道欧亚旋覆花总黄酮（ total flavones extracted from Inula Britannica L.，TFIB）注射液在休克、肾损伤、大脑缺血再灌注损伤中有保护作用[5、6]。然而有关歐亚旋覆花总黄酮对肢体缺血再灌注损伤的作用，目前尚无报道。本文用家兔肢体缺血再灌注损伤模型，探讨中药制剂欧亚旋覆花总黄酮对肢体缺血再灌注骨骼肌的作用。

1 材料与方法

1.1 欧亚旋覆花总黄酮的制备

取欧亚旋覆花适量加10倍量水，回流提取3 次，1 h/次，合并提取液浓缩;然后用AB-8大孔吸附树脂柱富集，提取物上样浓度为0.2 g/ml，用70%乙醇进行洗脱，冷冻干燥，测得总黄酮含量为89.5%[7]。

1.2 动物分组及模型的建立

健康成年家兔20只，随机分为对照组和实验组，每组10只。参照Crinnion等方法[8，9]建立肢体缺血再灌注损伤动物模型。术前12h禁食，3%戊巴比妥钠（40～60mg/kg）耳缘静脉注射麻醉。无菌手术暴露左大腿股血管鞘，于腹股沟韧带处用微血管夹阻断股动、静脉，在阻断处以下用橡皮带弹性环扎以阻断侧支循环。2h后取下橡皮带和血管夹，恢复肢体血供。在即将恢复血流再灌注时，从耳缘静脉注射欧亚旋覆花总黄酮注射液（50 mg/kg），对照组从耳缘静脉注射生理盐水注射液2ml。

1.3 检测项目及方法

对照组和实验组分别在缺血前、缺血后2h、再灌注后1h、再灌注后3h4个时相点自术侧股静脉采集血样，并取术侧胫前肌组织。

血清LDH、CK的测定：采用美国贝克曼CX-4型全自动生化分析仪测定血清中LDH、CK的含量（U/L）[10，11]。LDH、CK测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

骨骼肌组织湿/干重比值的测定： 取上述各时相点动物小块胫前肌肉标本称湿重后，置60℃恒温箱中，60h后称骨骼肌干重，然后计算骨骼肌组织湿/干重比值。

石蜡切片制备及光镜观察： 每组任选2只动物骨骼肌标本切成2cm×1 cm×0.5cm大小的组织块，固定于标本筐中，然后置于4%多聚甲醛液中固定6h。常规梯度乙醇脱水，透明，包埋，切片，HE染色，显微镜下观察并照相（每组取4个样本，每样本做4张切片，包括肌纤维纵横两个切面）。

超薄切片制备及电镜观察：将上述肌肉标本切成1mm3大小的组织块，经3%戊二醛液4℃前固定，0.2M二甲胂酸钠缓冲液冲洗，1%锇酸4℃后固定，常规梯度上行乙醇脱水，Epon812包埋剂浸透、包埋，超薄切片，H-7500型透射电镜观察并摄片。

1.4 统计学处理

所得数据用均数加减标准差表示（），统计学处理采用t检验。P<0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 血清中LDH、CK变化

血清LDH变化（表1）： 对照组再灌注后LDH明显增高（P <0.01）。再灌注后实验组LDH明显低于对照组（P <0.01）。

2.3 显微结构的变化

光镜观察：缺血后2h镜下见横纹肌纤维轻度变性（浊肿），部分横纹可见，肌核存在。再灌注后1h和再灌注后3h对照组见肌纤维明显水肿，横纹消失，部分区域肌核消失，胞浆凝固，肌核固缩（图A）。再灌注后1h和再灌注后3h实验组表现部分肌纤维轻度肿胀，间质水肿，肌核接近正常（图B）。

透射电镜观察：缺血2h后见肌纤维边缘线粒体有髓样变，糖原、内皮细胞改变不明显。对照组再灌注后3h显示线粒体髓泡样变和空泡样变、嵴断裂、糖原颗粒减少、双侧终池电子密度增高、横小管粗细不等（图C）。实验组再灌注后3h三联体、糖原颗粒较对照组增多，但肌纤维旁有髓样变线粒体，三联体较对照组完整（图D）。

3 讨论

本实验结果显示，血清中LDH、CK在缺血后2h较缺血前都有所升高，但升高不明显;再灌注后对照组较缺血前和缺血后2h明显升高（P<0.01）。光镜及电镜观察也发现骨骼肌在缺血后2h已出现损伤，但并不甚严重，再灌注后骨骼肌细胞损伤则非常明显，说明再灌注后细胞的损害并未停止而是进一步加重，即发生了缺血再灌注损伤。再灌注后3h血清LDH、CK两组均高于再灌注后1h，尤以对照组明显，提示可能在肢体缺血再灌注损伤后的一定时间内，灌注的时间越长则组织的损伤程度越重。而欧亚旋覆花总黄酮可减轻骨骼肌缺血再灌注损伤。用药后LDH、CK含量明显下降（P<0.01），说明对LDH、CK的释放有明显的抑制作用，保护组织细胞膜结构和功能的完整性，减轻骨骼肌细胞损伤程度。光镜及电镜的观察结果也表明实验组肌细胞损伤程度较同期对照组明显减轻。

骨骼肌组织湿/干重比值可反映组织损伤后水种程度。组织受损时，花生四烯酸代谢产物增多，吸收大量炎性细胞进入组织或粘附于血管内皮。由于炎性细胞浸润毛细血管壁，增加血管通透性，导致组织细胞水肿。随着骨骼肌组织损伤程度进一步加重，组织细胞水肿进一步增加，骨骼肌组织湿/干重比值明显增大。

实验结果显示再灌注后两组骨骼肌组织湿/干重比值较缺血前和缺血后2h有所升高，而实验组骨骼肌组织湿/干重比值则低于对照组。光镜及电镜观察到实验组组织水种程度较对照组明显减轻。说明欧亚旋覆花总黄酮具有显著的消肿作用，其消肿机制可能是一方面通过药物的物理作用，它有明显高渗脱水作用，减少水流入细胞内，将细胞内水分吸出细胞外，维持细胞容积，防止细胞及细胞器破裂;另一方面通过药物的化学作用，它能够清除氧自由基，通过阻断自由基的连锁反应，减轻氧自由基对骨骼肌细胞膜的脂质过氧化的损伤，保护内源性SOD和GSH活力，改善肌细胞代谢[3，4]。

缺血再灌注损伤机制非常复杂，已知有许多因素参与再灌注损傷过程，如自由基、兴奋性神经递质效应、细胞内钙离子超载、一氧化氮、炎性介质损伤等[5～6]，目前认为自由基损伤在其中发挥着重要的作用[7]。

本试验结果表明，欧亚旋覆花总黄酮对骨骼肌缺血再灌注损伤有保护作用。欧亚旋覆花总黄酮作为中药制剂，不存在排异反应;药源广泛，无明显毒副作用;欧亚旋覆花总黄酮具有吸收迅速、分布广泛的特点。因此，欧亚旋覆花总黄酮可应用于骨骼肌缺血再灌注损伤的治疗。

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【作者简介】杨昕宇，（1999-04），女，蒙，内蒙古通辽市，本科，临床药学系。