针刺对脑梗死大鼠骨骼肌ATP酶及血清CK、LDH活性的影响

张懿+施静+冯斯峰+刘梅芳+陈致宏+杜福生

摘要：目的從骨骼肌损伤标志酶的活性改变入手，探讨针刺对脑梗死后骨骼肌运动功能的改善作用，以进一步揭示其作用机制。方法健康雄性SD大鼠100只，体重（192±9）g，随机分为头针组、体针组、头针+体针组，模型组和空白组。每组20只。采用线栓法制作大鼠大脑中动脉局灶性脑梗死模型，并应用Zea-Longa的5级评分标准对造模大鼠进行筛选。每组分别于针刺治疗后即刻、24 h、48 h股动脉取血离心，检测ATP酶、CK、LDH活性。结果①模型组ATP酶活性在0h明显低于空白组（P<0.001），并与24h至48h之间回升；与模型组相比，头针加体针治疗组在0h（P<0.001），24h（P<0.01），48（P<0.05）小时差异均具有统计学意义，体针组在24h有显著性差异（P<0.001），增加ATP酶活性的作用达到峰值；头针组在0h差异具有统计学意义（P<0.05）。②模型组CK活性在48h明显高于空白组（P<0.001）；与模型组相比，三个针刺组中CK含量有明显变化，头针加体针治疗组在0h（P<0.05），24h（P<0.05），48h（P<0.01）差异均具有可比性；体针组在0h，48h有显著性差异（P<0.01）；头针组在24h有显著性差异（P<0.05）③模型组CK活性在0h、12h、48h均明显高于空白组（P<0.001）；与模型组比较，三个针刺组中LDH含量均有明显变化，头针加体针治疗组在0h（P<0.01）、24h（P<0.05）均具有可比性，体针组在48h有显著性差异（P<0.01），头针组在0h有显著性差异（P<0.01）。④头针+体针组与体针组在改变ATP、CK、LDH含量的变化方面无显著差异（P>0.05）。结论针刺可以增加ATP酶活性，降低血清CK及LDH活性，提高骨骼肌有氧酵解，增加肌细胞膜通透性，减轻骨骼肌损伤。

关键词：针刺；脑缺血；大鼠；骨骼肌；ATP酶、CK、LDH活性

中图分类号：R255.2文献标志码：A文章编号：1007-2349（2017）04-0087-04Effects of Acupuncture on ATPase and Serum CK and LDH Activity

in Skeletal Muscle of Rats with Cerebral Infarction

ZHANG Yi1， SHI Jing2， FENG Si-feng2， LIU Mei-fang2， CHEN Zhi-hong2， DU Fu-sheng1

（1. Yunnan Uinversity of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， Yunnan；

2. Yunnan Traditional Chinese Medicine Hospital， Kunming 650021， Yunnan）

【Abstract】Objective： To study the effect of acupuncture on skeletal muscle motor function after cerebral infarction， and to reveal its mechanism from the changes of skeletal muscle injury marker enzyme activity. Methods： 100 healthy male SD rats weighing 192±9 g were randomly divided into a scalp acupuncture group， a body acupuncture group， a scalp + body acupuncture group， a model group and a blank group， 20 rats per group. The suture method was used to establish rat models of focal cerebral infarction and Zea-Longa's five-level scoring standard was used to screen the model rats. The activity of ATPase， CK and LDH of each group were measured by centrifugation at 24 h and 48 h after acupuncture treatment. Results： 1. The activity of ATPase in the model group was significantly lower than that in the blank group （P<0.001） at 0h， and recovered from 24h to 48h. Compared with the model group， the scalp acupuncture group showed significant differences at 0h （P<0.001）， 24h（P<0.01）， and at 48h （P<0.05）. The body acupuncture showed the significant difference at 24h（P<0.001）and the effect of increasing activity of ATPase reached the peak. The scalp acupuncture group showed the difference was statistically significant. 2. CK activity in the model group was significantly higher than that in blank group at 48h （P<0.001）. Compared with model group， CK contents in three acupuncture groups significantly changed at 0h （P<0.05）， 24h （P<0.05） and 48h （P<0.01）.The differences were comparable. The body acupuncture group had significant difference at 0h and 48h （P<0.01）. The scalp acupuncture had significant difference at 24h （P<0.05）. 3. CK activity in the model group was significantly higher than that in the control group （P<0.001） ， at 0h， 12h and 48h. Compared with the model group， the levels of LDH in the three acupuncture groups significantly changed. The difference of the scalp + body acupuncture group was comparable， at 0h （P<0.01） and 24h （P<0.05）. The body acupuncture group had significant difference at 48h （P<0.01）. And the scalp acupuncture group had significant difference at 0h （P<0.01）. 4. The scalp + body acupuncture group had no significant difference in the changes of ATP， CK and LDH contents （P>0.05）. Conclusion： Acupuncture can increase the activity of ATPase， decrease the activity of serum CK and LDH， improve the aerobic glycolysis of skeletal muscle， increase the permeability of muscle membrane and reduce skeletal muscle injury.

【Key words】acupuncture， cerebral ischemia， rat， skeletal muscle. ATPase， CK， activity of LDH

脑梗死具有极高的致残率，超过2/3的脑梗死患者伴有肢体功能障碍[1～2]，主要包括骨骼肌无力、关节挛缩以及肌肉萎缩等。骨骼肌的继发性损伤是导致肢体功能障碍的主要原因之一，现代研究表明脑梗死后4 h即可以观察到患侧骨骼肌适应性的改变[3]，从而导致肌肉运动模式的改变，引起肢体功能障碍[4]。针刺作为一门传统医学，治疗脑梗死后肢体功能障碍疗效显著[5-6]，近年来，已应用多种客观指标观察针刺对脑梗死的恢复作用，如血液流变[7]、免疫机制[8]、神经保护因子等[9]，但针刺对脑梗死后骨骼肌的恢复作用的研究尚不多见。课题组前期开展多中心、大样本研究已证实针刺可有效促进脑梗死患者骨骼肌功能的恢复。也有研究证明穴位电刺激可改变大鼠骨骼肌ATP酶、CPK、LDH，并可改变骨骼肌细胞胞浆内游离钙浓度，对肌肉快速收缩和舒张产生积极效果[10～11]。为进一步探索针刺对脑梗死大鼠骨骼肌损伤后的改善作用机制，本试验基于能量代谢的基础上，观察不同针刺时间对骨骼肌ATP酶、CK、LDH活性的变化的影响。

1材料与方法

1.1试验材料2月龄健康雄性SD大鼠100只，体重（192±9）g，购于昆明动物研究所实验动物中心（实验动物许可证号SCXK2010-0006）。实验室温度（24±2）℃，湿度（50±5）%，光照时间8：00-20：00，自由饮水和进食，普通大鼠饲料购于昆明动物研究所实验动物中心。术前12h禁食。

1.2脑梗死模型的建立以10%水合氯醛（4 mL/kg）注射于大鼠腹腔内进行麻醉，均保留自主呼吸。麻醉后采用腔内线栓法制备大鼠左侧中动脉局灶性脑梗死模型。大鼠仰卧固定于手术台，常规颈部备皮，于颈部正中偏左侧切口，逐层分离右侧的颈总、颈内及颈外动脉，结扎颈外动脉，并于颈总动脉近心端及 “V”型分叉处放置动脉夹，将尼龙线末端点涂石蜡形成光滑线头，置入两动脉夹之间，长度约18 mm，直至稍遇阻滞感停止进线，结扎线栓及颈总动脉，以防止出血和线栓脱落，放开动脉夹，缝合皮肤。

1.3模型纳入排除标准参照Zea-Longa的5级评分标准对造模大鼠进行筛选[12]，0分提示未见神经病学征象；1分提示轻度局灶性神经功能缺失，大鼠被提尾悬空时病灶对侧前肢呈屈曲、抬高状等；2分提示中度局灶性神经功能缺失，出现向瘫痪侧旋转征象；3分提示重度局灶性神经功能缺失，有向瘫痪侧跌倒征象；4分提示无自发活动及意识水平下降。评分在1-3分为造模成功。以下两种情况为造模失败，予以剔除：①实验过程中大鼠死亡。②规定时间处死动物时见有蛛网膜下腔出血或颈内动脉分叉部出血。

1.4实验分组苏醒后大鼠按照上述方法进行评分，参加试验大鼠共100只，模型制备过程中死亡6只，造模失败9只，最终1-3分共85只大鼠纳入试验。按照数字随机表法分为头针组、体针组、头针+体针组，模型组和空白组。每组17只。组间动物体重均无显著性差异。

1.5针刺干预方案大鼠取穴的定位及针刺手法均参照华兴邦等研制的《大鼠穴位图谱》。头针组：针刺大鼠的头穴：百会、风府，留针5 min，每日1次；体针组：针刺大鼠后会、环跳、前三里、阳陵泉、后三里，留针5 min，每日1次；头针+体针组：针刺大鼠的百会、风府、后会、环跳、前三里、阳陵泉、后三里，留针5 min，每日1次；模型组：造模后不施加任何刺激；空白组：空白对照不造模，正常喂养

1.6标本采集及指标检测分别于每组针刺即刻、24 h、48 h于大鼠腹主动脉取血，采用南京建成生物工程研究所提供的ATP酶（产品货号A016-2）、CK（产品货号A032）、LDH（产品货号A020-2）试剂盒和帝肯酶标仪（型号：Sunrise RC TS TC，产地：奥地利）进行检测，具体检测过程严格按照说明书进行。

1.7统计学方法报告中所有数据采用 SPSS 22.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较选择LSD 法，以P<0.05为差异有显著性。

2结果

2.1针刺不同时刻对大鼠ATP酶活性的影响由表1、图1可以看出，与模型组相比，头针加体针治疗组在0、24、48 h差异均具有统计学意义，体针组在24 h有显著性差异（P<0.001），增加ATP酶活性的作用达到峰值；头针组在0h差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.2针刺不同时刻对大鼠CK活性的影响由表2、图2可以看出，模型组CK活性在48h明显高于空白组（P<0.001）；头针加体针治疗组在0、24、48 h差异均具有可比性；体针组在0 h，48 h有显著性差异（P<0.01）；头针组在24 h有显著性差异（P<0.05）

2.3针刺不同时刻对大鼠LDH活性的影响由表3、图3可以看出，模型组CK活性在0h、12h、48h均明显高于空白组（P<0.001）；头针加体针治疗组在0h（P<0.01）、24h（P<0.05）均具有可比性，体针组在48h有显著性差异（P<0.01），头针组在0h有显著性差异（P<0.01）

3讨论

脑梗死后患者多伴有骨骼肌萎缩失用，许多研究表明骨骼肌出现病理性变化是脑梗死后肢体残疾的重要原因[13]，而能量代谢与骨骼肌功能的正发挥有着密切的关系。大量研究证实，针灸对脑梗死后的骨骼肌萎缩产生良性调节作用。

ATP酶是影响肌肉收缩张力和收缩速率的重要因素，是判断肌肉收缩能力的重要生化指标[14～17]。乳酸脱氢酶（LDH）是糖原无氧酵解的关键酶之一，能保证肌肉在短暂缺氧时仍能获得ATP，评价骨骼肌受损情况。肌酸激酶CK在骨骼肌中含量最多，当肌细胞膜受损时，血液中CK含量明显升高，因此，通过针刺干预肌肉内能量的转化可判断损伤骨骼肌的恢复状态[18～19]。本试验结果认为①造模成功后，机体处于缺氧状态，骨骼肌线粒体氧化磷酸化功能受损，ATP酶生成减少，活性显著降低。当针刺介入后ATP酶含量出现增高趋势，其中头针+体针组在针刺即刻疗效最为显著，48h后ATP酶含量已与正常水平无差异。体针组ATP酶含量呈先增高后降低的态势，于24h异常增高，超出正常水平。②大鼠脑梗死后0h即出现血清LDH活性的增高。这种现象出现的原因可能是脑梗死后缺氧状态下骨骼肌细胞内离子代谢紊乱，大量自由基生成造成细胞膜通透性改变，此时LDH通过细胞膜进入血液中，造成血液中LDH含量的异常增高。还可能是因为脑梗死缺氧状态下骨骼肌中ATP酶活性显著降低，吸收和代谢过程受阻，有氧化受阻，无氧酵解活跃，与进行无氧酵解相关的LDH的活性相应地升高，使其在肌肉的能量代谢过程中发挥重要作用，这是机体的一种代偿性反应。③血清CK在脑梗死24h之后出现大幅度增高，可能在48h达到峰值。其变化与LDH类似但并不一致，均可能与细胞膜的损害有关。针刺介入后，头针+体针组于即刻短暂升高后逐渐降低，但48h后仍没有达到正常水平，CK活性的变化与LDH两者之间的关系仍需要进一步试验支持。研究结果表明头针和体针穴位均对肌细胞膜有保護作用，其机制可能是，头针和体针穴位可以清除机体内的过剩自由基，提高有氧酵解，维从而持细胞膜Na+、K+的稳定转运，减少对肌细胞膜的伤害，保持细胞膜的良好通透性，从而减少血液中LDH、CK流出，从而改善骨骼肌微血管机能状态，保护骨骼肌，最终达到了恢复脑梗死后骨骼肌运动能力的目的。

通過动物实验证明，大鼠脑梗死骨骼肌损伤后，头针+体针组在改善ATP酶及血清CK及LDH活性方面疗效较为稳定，可以提高骨骼肌有氧酵解，增加肌细胞膜通透性，减轻骨骼肌损伤，在临床实验中，针刺是否会对脑梗死后骨骼肌的能量代谢产生上述影响以及其中的作用机制仍有待进一步研究。

参考文献：

[1]Thorvaldsen P，Kuulasmaa K，Rajakanga SAM，etal.Stroke trends in the WHO MONICA project[J]，Stroke，1997，28：500-506.

[2]Gresham GE，Phillips TF，Wolf PA，et al.Epidemiologic profile of long term stroke disability.The Framingham study[J].Arch Phys Med Rehabilitation，1979，60（11）：487-491.

[3]Arasaki K，Igarashi 0，Ichikawa Y，et al.Reduction in the motor unit number estimate（MUNE）after cerebral infarction[J].Neurol Sci.2006：250：27-32.

[4]Hafer-Macko CE，Ryan AS，Ivey FM，et al.Skeletal muscle changes after hemiparetic stroke and potential beneficial ef-fects of exercise interve-ntion strategies[J].J Rehabil Res Dev，2008，45（2）：261-272.

[5]高文祥，柳君泽，吴利平，等.急、慢性缺氧对大鼠脑线粒体能量代谢的影响[J].中国病理生理杂志，2000，10：16-19.

[6]张敏，陈立军，史娜，等.骨骼肌肌浆网Na～+，K～+-ATP酶和Ca～（2+）-ATP酶活性在不同训练条件下的变化[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，37：6963-6966.

[7]周杰芳，靳瑞.针刺对中风患者微循环与血液流变学作用的观察[J].广州中医学院学报，1991，8：（23）.

[8]王润芳.针刺治疗急性脑梗死的免疫调节机制研究[D].山西中医学院，2013.

[9]凌丽，方邦江.中医药治疗促进脑梗死后血管新生作用的研究进展[J].世界中药，2015，03：452-456.

[10]杨华元、谢佳吟，顾顺杰，等.穴位电刺激对大鼠骨骼肌能量代谢的影响[J].中国针灸，2001，21（4）：239-240.

[11]马海峰，吴瑛.穴位电刺激对大鼠骨骼肌胞浆钙离子浓度的影响[J].中国运动医学杂志，2005，24（1）：100-102.

[12]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke.1989；20（1）：84-91.

[13]Scherbakov N，Doehner W.Sarcopenia in stroke-facts and numbers on muscle lossaccounting for disability after stroke[J].J Cachexia Sarcopenia Muscle，2011，2：5-6.

[14]ACKERMAN S H，TZAGOLOFF A.Function，structure，and biogenesis of mitochondrial ATP synthase[J].ProgNucleic Acid Res Mol Biol，2005，80：95-133.

[15]周锦琳，田野.急性运动对大鼠骨骼肌线粒体Ca2+-ATP 酶和 H+-ATP 酶活性的影响[J].北京体育大学学报，2001，24（3）：320-323.

[16]詹承烈，龙云芳，黄宇霞.太极拳运动对中老年人红细胞膜Na+-K+-ATP 酶和Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性的影响[J].预防医学情报杂志，2002，18（1）：30-32.

[17]季丽萍，冯照军.间歇性训练和持续性训练对大鼠胖肠肌 ATP 酶活性的影响[J].体育与科学，2004，25（1）：64-65.

[18]康纯洁，王天芳.消疲怡神口服液对慢性束缚致大鼠疲劳骨骼肌能量代谢的影响[J].北京中医药大学学报，1999，22（4）：21-23.

[19]Landin S，Hagenfeldt L，Saltin B，et al.Muscle metabolism during exercise in hemiparetic patients[J].Clin Sci Mol Med，1977，53（3）：257-269.