CsCAT3克隆与其在冷驯化诱导采后黄瓜耐冷性中的作用初探

王 斌 武春爽 何金明 王 光 曲姗姗 朱世江

(1韶关学院英东生物与农业学院，广东 韶关 512005；2华南农业大学园艺学院，广东 广州 510642)

黄瓜(Cucumis sativusL.)是我国主要栽培的设施蔬菜，果实是其最主要的商品器官[1]。黄瓜采收后，由于其组织鲜嫩，含水量高，常温贮藏极易腐烂变质，导致商品性降低甚至丧失，造成严重的经济损失[2]。因此，生产上通常采用低温贮运保持采后黄瓜的商品性。但采后黄瓜对低温敏感，贮藏温度低于10℃时容易发生冷害[3]。产生冷害的黄瓜在货架期极易被病原微生物感染，导致严重的次生病害，使得商品性降低[4]。因此，采取一定的措施诱导采后黄瓜耐冷性，对于减轻冷害并防止次生病害具有重要意义。

过氧化氢酶(catalase，CAT)是一种重要的抗氧化防御酶，其功能主要是清除光呼吸、线粒体电子链传递以及β－脂肪酸氧化等过程中产生的过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)，以避免活性氧(reactive oxygen species，ROS)对植物造成氧化损伤[5]。大多数植物基因组仅含有3 个CAT基因，根据在不同组织中的表达差异，CAT基因被分为3 个类型[6]。Ⅰ类CAT基因在光合组织中高表达，Ⅱ类在维管组织中高表达，而Ⅲ类在生殖器官中高表达[7]。在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中，AtCAT1、AtCAT2 和AtCAT3 分别属于Ⅲ类、Ⅰ类和Ⅱ类CAT基因[8]。研究表明，CAT的表达与植物抗逆性密切相关。拟南芥AtCAT2 可被低温和干旱胁迫显著诱导，而AtCAT3 可被氧化胁迫所诱导[9]。干旱胁迫能显著影响斑茅(Erianthus arundinaceus)EaCAT－1b和甘蔗(Saccharum officinarumL.)SoCAT－1c的表达[10]。番茄(Solanum lycopersicum)中过表达大肠杆菌katE基因，能明显增强叶片对光氧化损伤胁迫的耐受性[11]。拟南芥中超表达西兰花BoCAT，显著提高了耐热性[12]。

盐胁迫和干旱胁迫抑制黄瓜幼苗CsCAT1 和CsCAT2 的表达，但可以诱导CsCAT3 表达，而低温胁迫对黄瓜幼苗CsCAT1、CsCAT2、CsCAT3 表达的影响不明显[7]。在大肠杆菌中过表达黄瓜CsCAT3，增强了宿主细胞对热胁迫、低温胁迫、盐胁迫和渗透胁迫的耐受性[13]。本团队前期研究发现，外源茉莉酸甲酯和一氧化氮处理采后黄瓜，提高了CsCAT3 表达以及CAT 活性，从而增强冷藏黄瓜的抗氧化能力和耐冷性[14]。同样，冷驯化处理也能显著诱导采后黄瓜耐冷性，减少冷害发生[15－16]，但冷驯化诱导的耐冷性是否与CsCAT3的表达有关，值得进一步研究。

本研究通过克隆CsCAT3 基因，研究冷驯化对CsCAT3 基因表达和CAT 活性的影响，旨在探明CsCAT3 表达在冷驯化诱导耐冷性中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料及处理

本研究选用黄瓜品种为翠夏(由广东金穗现代种业有限公司培育)，在园艺成熟度时采收，并及时运回广东省果蔬保鲜重点实验室，室温条件下，3 h 内运回实验室。挑选果形和大小基本一致、无机械伤、无病虫害的供试黄瓜，设置对照组和处理组。对照组直接贮藏在5℃冷库，处理组先于10℃贮藏3 d，再贮藏于5℃冷库，每组60 根黄瓜，处理设置3 个重复，即每个重复20 根黄瓜。依次在贮藏当天(0 d)和贮藏期间(3、6、9 和12 d)采样，每个处理取3 根黄瓜，削去果皮，液氮速冻后保存于－80℃冰箱。所取样品用于酶活性测定、总RNA 和总蛋白提取等试验。

1.2 试剂与菌株

植物总RNA 提取试剂盒(RNApre Pure Plant Plus Kit)购自北京天根生化科技有限公司；反转录试剂盒(iScript cDNA Synthesis Kit)、3－[(3－胆酰胺丙基)二甲基铵基] －1－丙磺酸盐(3-[(3-(holamidopropyl)dimethy lammonio]-1-propane sulfonate，CHAPS) 和30%聚丙烯凝胶酰胺由美国Bio-Rad 公司生产；普通Taq 酶和高保真DNA 聚合酶、PCR 产物回收试剂盒、质粒提取试剂盒、二硫苏糖醇(1，4-dithio-DL-threitol，DTT)和氨苄霉素均购自上海生工生物工程有限公司；大肠杆菌感受态DH5α 购自上海唯地生物有限公司；克隆载体pMD18-T 购自日本TaKaRa 公司。

丙酮、乙酸、甲醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸钛和30%过氧化氢，产自广州化学试剂厂；考马斯亮兰R250，产自上海碧云天生物技术有限公司；牛血清蛋白，产自美国Sigma 公司；β－巯基乙醇，购自广州华奇盛生物科技有限公司；两性电解质Ampholine、Tris－饱和酚、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF) 和聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)，购自健阳生物科技有限公司；Triton-X100 和尿素，购自北京鼎国生物技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 RNA 提取和反转录 使用RNA 提取试剂盒提取黄瓜果皮总RNA，利用反转录试剂盒合成单链cDNA。总RNA 提取和反转录的步骤与具体方法按照试剂盒说明书进行。

1.3.2 黄瓜CsCAT3 克隆 将拟南芥AtCAT3(NM_101913.4)序列提交到黄瓜基因组数据库(http:/ /www.cucurbitgenomics.org/)进行BLAST 比对，得到黄瓜CsCAT家族基因的核苷酸序列，将与AtCAT3 同源性最高的基因命名为CsCAT3。

以cDNA 为模板，使用特异引物(正向:5′-ATGGA TCCTTACAAGTACCGTCCA-3′；反向:5′-TTAGATGTTT GGCCTCACATTCA-3′)扩增CsCAT3 全长序列，引物由上海生工生物工程有限公司(广州分公司)合成。用高保真DNA 聚合酶进行PCR 扩增，PCR 反应条件和步骤如下:95℃预变性3 min；95℃变性10 s，60℃退火45 s，72℃延伸30 s，35 个循环；延伸10 min。PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳，回收纯化PCR 产物。回收产物在3′端加A 后连接pMD18-T 载体，使用热激法转化大肠杆菌DH5α 感受态。转化方法如下:将10 μL连接反应液加至100 μL 的DH5α 感受态中，冰上静置30 min，42℃热激90 s，立即冰浴5 min。将转化重组质粒的DH5α 大肠杆菌预培养1 h 后，待抗性基因充分表达，取适量预培养的菌液涂板在含氨苄霉素的固体LB 培养基上，37℃过夜培养。挑取阳性克隆的DH5α 菌落送至上海生工生物工程有限公司(广州分公司)进行测序验证。

1.3.3 生物信息学分析 通过Cell-PLoc 2.0(http:/ /www.csbio. sjtu. edu. cn/bioinf/plant-multi/) 和pLoc_Deep-mPlant(http:/ /www. jci-bioinfo. cn/pLoc _ DeepmPlant/)在线工具预测CsCAT3 蛋白的亚细胞定位；使用NCBI 数据库的CDD(https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)预测其保守结构域[17]。使用 ExPASy ProtScale ( https:/ /web. expasy. org/protscale/)分析其理化性质。用SignalP－5.0 (http:/ /www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行蛋白质信号肽分析。采用ExPASy TMpred 网站(https:/ /embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)对其跨膜结构域进行预测，得分超过500 即被认为存在显著意义。利用SOPMA (https:/ /npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page ＝npsa_sopma.html)预测CsCAT3 蛋白的二级结构。利用 SWISS-MODEL ( https:/ /swissmodel.expasy.org/)对其三级结构进行预测。最后，利用DNAMAN 对CsCAT3 蛋白与其同源蛋白进行氨基酸序列多重比对，利用在线工具WebLogo(http:/ /weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)对CsCAT3 及同源蛋白的氨基酸保守性进行分析，并以MEGA 7.0 中的邻接法(neighbor-joining，NJ)构建系统发育进化树。

1.3.4 半定量RT-PCR 分析 以cDNA 为模板，CsActin(登录号:AB010922.1)作为内参基因，分别扩增CsCAT3 和CsActin基因。扩增CsActin的正向引物序列为5′-AGGCCGTTCTGTCCCTCTAC-3′，反向引物序列为5′-CAGTAAGGTCACGACCAGCA-3′。扩增CsCAT3的引物信息、PCR 反应条件和步骤同1.3.2。

1.3.5 Western blot 分析 使用Tris－酚抽提法提取总蛋白[11]，具体方法如下:称取5 g 研磨成粉状的果皮，加入20 mL 蛋白提取液(内含0.1 mmol·L－1Tris-HCL、1%β－巯基乙醇、0.1%Triton-X100、1 mmol·L－1PMSF、10%PVP，pH 值9.0)，4℃涡旋混匀，12 000 r·min－1离心20 min，收集上清液。上清液中加入等体积的Tris－饱和酚(pH 值8.0)，充分混匀，4℃、12 000 r·min－1离心20 min。取酚层，加入5 倍体积的0.1 mol·L－1乙酸甲醇溶液，－20℃沉淀2 h。4℃、12 000 r·min－1离心20 min，沉淀用预冷的甲醇和丙酮分别洗涤1 次。在沉淀中加入适量裂解液[内含9 mol·L－1尿素，1%DTT，2%CHAPS、1%两性电解质(pH 值3.5～9.0)]，室温裂解1 h。采用考马斯亮蓝法测定总蛋白浓度[18]，提取的黄瓜果皮总蛋白浓度在1.5～6.0 mg·mL－1之间。

各取样点使用相同用量(5 μg)的总蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)垂直电泳。电泳完成后，依次进行转膜、洗膜、封闭抗体、显色、成像等操作。所用CsCAT3 单克隆抗体由广东省果蔬保鲜重点实验室制备[19]。

1.3.6 CAT 活性和H2O2含量测定 称取1 g 研磨充分的样品，加入5 mL 0.2 mol·L－1磷酸缓冲溶液(pH值7.8)，冰上涡旋混匀。在4℃、12 000 r·min－1条件下离心15 min，收集上清，用于测定CAT 活性。

称取1 g 样品，加入5 mL 冷丙酮充分研磨。4℃下12 000 r·min－1离心15 min，收集上清，用于测定H2O2含量。

CAT 活性和H2O2含量的测定按照Wang 等[15]方法进行。吸光度值每降低0.01 表示为1 个CAT 活性单位(U)。

1.4 数据分析

采用Excel 2016 软件整理和分析数据，并制作图表。使用SPSS 15 软件检验处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 黄瓜CsCAT3 的克隆

以黄瓜果皮cDNA 为模板，使用特异引物进行PCR 扩增。从PCR 产物电泳图中看出，扩增出了一条与预期结果相符的目的条带(1 479 bp)(图1-A)。经测序鉴定，克隆到的序列与基因组[(Chinese Long)genome v3]中公布的CsCAT3 全长序列完全一致，表明成功克隆到了CsCAT3 全长。CsCAT3 定位在6 号染色体，含有4 个内含子和5 个外显子。其中，第5 个外显子最长，长1 149 bp(图1-B)。

图1 黄瓜CsCAT3 全长PCR 电泳图(A)及其在染色体上的定位(B)Fig.1 Electrophoresis image of full length of cucumber CsCAT3 gene (A) and it’s location in chromosome (B)

2.2 黄瓜CsCAT3 蛋白基本特性

使用ProtParam 工具分析了CsCAT3 蛋白的基本特性，CsCAT3 蛋白的理论分子量和等电点分别为57.01 kDa 和6.84。由492 个氨基酸残基组成，氨基酸序列中的天冬氨酸和丝氨酸所占比例最高，分别为7.9%和7.5%。带负电荷和正电荷的残基总数分别为60 和58，分子式为C2562H3869N721O727S19。不稳定系数为42.25，表明黄瓜CsCAT3 是一个不稳定蛋白。

ExPASy ProtScale 预测的CsCAT3 蛋白的亲水性得分均值为－0.49(图2-A)，脂肪族指数为－0.546，表明CsCAT3 是一种亲水性蛋白质。CsCAT3 蛋白的跨膜结构域预测得分小于500，表明不存在跨膜结构域(图2-B)，且没有信号肽。

图2 黄瓜CsCAT3 蛋白基本特性Fig.2 Basic characteristics of cucumber CsCAT3 protein

CsCAT3 蛋白的二级结构以无规则卷曲(红色)为主，占总体结构的49.80%，其次为α 螺旋(蓝色，27.24%)、β 折叠(绿色，6.30%)和β 片层(紫色，16.67%)(图2-C)。以CsCAT3 氨基酸序列为模板建模，CsCAT3 蛋白的三级结构与短小芽孢杆菌CAT(SMTL ID: 4qol.1)的三级结构相似性最高。SWISSMODEL 网站构建的CsCAT3 蛋白的三级结构如图2-D所示。CsCAT3 蛋白的三级结构由4 个中心对称的亚基构成，表明其可能通过形成中心对称的四聚体结构行使功能。

使用Cell-PLoc 2.0 和pLoc_Deep-mPlant 在线工具预测CsCAT3 蛋白的亚细胞定位，两个工具预测的结果均显示，CsCAT3 蛋白定位在过氧化酶体中(图2-E)。

2.3 不同物种CAT3 核苷酸序列同源性分析

对CsCAT3(CsaV3_6G031490)和其他4 种模式植物CAT3 基因的核苷酸序列进行BLAST 比对，发现CsCAT3 与其他CAT3 的相似性为69.29%～71.82%，CsCAT3 与番茄SlCAT3(XM_004238382.3)同源性最高，与水稻OsCAT3(XM_015787591.2)的同源性最低(表1)。不同植物的CAT3 基因同源性为69.29%～91.89%(表1)，表明物种间的CAT3 基因高度同源。

表1 不同物种CAT3 基因同源性比较Table 1 Homology comparison of CsCAT genes in different plant species

2.4 不同物种CAT3 蛋白同源性和保守性分析

5 种植物CAT3 蛋白均由492 个氨基酸残基组成，且序列之间的相似性非常高。氨基酸序列中均含有CAT 蛋白保守域，由297 个氨基酸构成(图3)。表明植物CAT3 蛋白高度同源，证实本试验成功克隆到了黄瓜CsCAT3 基因。

氨基酸保守性分析中，氨基酸字母高度越高，保守性越好。由图4 可知，5 种植物的CAT3 蛋白保守性很高，表明植物CAT3 氨基酸在进化过程中高度保守。

根据5 种植物的CAT3 氨基酸序列构建进化树(图5)。结果显示，黄瓜CsCAT3(CsaV3_6G031490)与4 种模式植物CAT3 的进化距离都很近，与番茄SlCAT3(XP_004238430.1)的进化距离最近，其次由近到远依次是烟草NtCAT3(NP_001312022.1)、拟南芥AtCAT3(NP _ 564120.1) 和 水 稻 OsCAT3 ( XP _015643077.1)。进化树结果反映了物种间CAT3 蛋白的亲缘关系，再次证明克隆到的基因是CsCAT3。

2.5 冷驯化处理对采后黄瓜CsCAT3 基因和蛋白表达的影响

为探究冷驯化诱导的耐冷性与黄瓜CsCAT3 表达的关系，检测了CsCAT3 在转录和蛋白水平上的表达情况。由图6 可知，对照组中，在冷藏期间CsCAT3 基因的表达逐渐降低，在贮藏12 d 时表达量下降到非常低的水平。而在冷驯化处理中，与贮藏0 d 相比，冷驯化处理在贮藏1 d 时上调了CsCAT3 基因表达。此后，尽管CsCAT3 表达也随时间延长而降低，但表达量明显高于对照，表明冷驯化处理诱导了黄瓜CsCAT3 基因的表达。

在蛋白表达水平，黄瓜CsCAT3 蛋白的表达趋势与转录水平基本一致。对照组和冷驯化处理组中，CsCAT3 蛋白的表达在贮藏3 d 时轻微上调，随后逐渐降低。但冷驯化处理组的表达量均明显高于对照组(图7)，从蛋白层面再次证实冷驯化处理诱导了CsCAT3 表达。

2.6 冷驯化处理对采后黄瓜CAT 活性和H2O2 含量的影响

由图8－A 可知，对照组的CAT 活性总体呈下降趋势，而冷驯化处理组的CAT 活性先增加后降低，在贮藏6 d 时活性最高。此外，冷驯化处理组的CAT 活性显著高于对照组(除贮藏0 d)，表明冷驯化处理诱导了CAT 活性，这可能是CsCAT3 基因表达上调的结果。

由图8－B 可知，对照组和冷驯化处理组的H2O2含量均先增加后降低，除0、3 d 外，处理组的H2O2含量均显著低于对照组。表明冷驯化通过增强CAT 活性，提高了对H2O2的清除能力，减轻了由H2O2过量所导致的氧化胁迫。贮藏3 d 时，处理组H2O2含量显著高于对照组，表明冷驯化在贮藏前期诱导了H2O2。H2O2是一种重要的信号分子，在诱导防御基因表达方面具有重要作用，推测H2O2在冷驯化诱导CAT3 表达过程中发挥了作用。

3 讨论

图3 黄瓜CsCAT3 蛋白与4 种模式植物CAT3 氨基酸序列比对Fig.3 Amino acid sequence alignment between cucumber CsCAT3 protein and four CAT3 from model plants

CAT广泛存在于植物体中，其功能涉及植物生长发育以及抗逆性等多个方面，包括提高光合能力[20]、增强抗逆性[21－22]、延缓衰老[23]、提高细胞全能性[24]、控制胞内氧平衡[25]等，最主要的功能是增强植物细胞的抗氧化性[26－27]。植物CAT 家族蛋白的分子量在55～69 kDa 之间，是由4 个亚基组成的四聚体(Tetramer)血红蛋白，有保守的活化中心和铁血红蛋白结合位点[28]。本研究从黄瓜果皮中克隆到了CsCAT3 基因，其全长1 479 bp，编码492 个氨基酸残基。生物信息学分析结果显示，黄瓜CsCAT3 蛋白没有跨膜结构域和信号肽，是一个亲水性不稳定蛋白，表明该蛋白是一种可溶性蛋白，不能分泌到胞外，与刘云芬[19]的研究结果一致。三级结构分析显示，CsCAT3 蛋白由4 个亚基构成，且4 个亚基形成一个中心对称的稳定四聚体，表明该蛋白是一个典型的CAT 蛋白。

研究表明，植物CAT 家族蛋白主要分布在过氧化物酶体、乙醛酸循环体和细胞质中，少数CAT 蛋白定位在线粒体内[8]。线粒体、叶绿体、质外体和过氧化物酶体中均可产生H2O2，其中由非生物胁迫导致的H2O2主要由过氧化物酶体产生，CAT 在清除H2O2中发挥重要作用[29]。借助亚细胞分离和原位活性染色技术，Mhamdi 等[30]发现过氧化物酶体中的CAT 活性最高，且其他细胞器中的CAT 可以转移到过氧化物酶体。本研究结果表明，黄瓜CsCAT3 蛋白定位在过氧化物酶体中。定位在过氧化物酶体的CAT3 可在原位转化成具有活性的CAT 酶，从而及时清除由各种胁迫引起的H2O2含量增加，这可能是植物应对非生物胁迫的一种重要防御机制。

图4 黄瓜CsCAT3 蛋白与四种模式植物CAT3 氨基酸序列保守性比较Fig.4 Conservation comparison of amino acid sequence between cucumber CsCAT3 protein and four CAT3 from model plants

与其他生物不同的是，植物一般生长在一个固定位置，不能自主移动。为了存活，植物在进化过程中要不断进化，从而适应环境变化。抗氧化防御系统是植物应对环境变化的重要防御机制[31]，在进化过程中通常会保留。本研究结果显示，黄瓜CsCAT3 蛋白与4种模式植物的CAT3 的同源性和保守性很高，进化关系很近，表明植物CAT3 在进化过程中高度保守。

图5 黄瓜CsCAT3 蛋白与4 种模式植物CAT3的亲缘关系Fig.5 Evolutionary relationship between cucumber CsCAT3 protein and four CAT3 from model plants

冷害是限制低温贮运技术在采后产业中广泛应用的主要因素之一，通过一定的方式处理采后果蔬，可诱导其产生抗冷性，从而减轻冷害症状，减少采后损失[3]。研究表明，冷驯化是一种有效诱导采后黄瓜耐冷性的处理方式[4，15－16]。作为重要的抗氧化防御酶，CAT 在增强植物抗逆性中发挥重要作用[32]。在水稻中过表达大肠杆菌katE，提高了水稻CAT 活性和对盐胁迫的耐受性[33]。拟南芥突变体cat2 的CAT 活性只有野生型的10%，而突变体cat1 和cat3 的CAT 活性比突变体cat2 更低[8]。本研究中，冷驯化上调了CsCAT3在转录和蛋白水平的表达，表明冷驯化处理诱导了采后黄瓜CsCAT3 表达，这可能是CAT 活性在冷驯化处理中较高的重要原因。而高活性的CAT 能及时清除H2O2，减轻由H2O2过量而导致的氧化胁迫。这些结果表明，冷驯化通过诱导CsCAT3 表达，提高了冷藏黄瓜的抗氧化能力，使得冷藏黄瓜耐冷性增强。

4 结论

CsCAT3 是典型的植物CAT 家族基因，且不同植物的CAT3 高度保守。冷驯化处理诱导了采后黄瓜CsCAT3 在转录和蛋白水平的表达，提高了CAT 活性，缓解了氧化胁迫，表明CsCAT3 在冷驯化诱导的耐冷性中具有重要作用。

图6 冷驯化对冷藏黄瓜CsCAT3 基因表达的影响Fig.6 Effects of pre-storage cold acclimation on the expression of CsCAT3 gene in cold-stored cucumber

图7 冷驯化对冷藏黄瓜CsCAT3 蛋白表达的影响Fig.7 Effects of pre-storage cold acclimation on the expression of CsCAT3 protein in cold-stored cucumber

图8 冷驯化对冷藏黄瓜CAT 活性(A)和过氧化氢含量(B)的影响Fig.8 Effects of pre-storage cold acclimation on the CAT activities (A) and H2O2 contents (B) in cold-stored cucumber