lncRNA ZSWIM8-AS1对结直肠癌细胞RKO增殖、凋亡、迁移和放射敏感性的影响

侯 歌，张家杰，肖陈虎，宋 锐，黄洋洋，袁金金，柴 婷，刘宗文

1)郑州大学第二附属医院肿瘤放疗科 郑州 450014 2)西北大学生命科学学院 西安 710069

结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，具有较高的发病率和病死率，严重威胁人类生命健康[1]。结直肠癌的治疗手段主要有外科手术、放疗和化疗等，手术切除肿瘤前放疗能够延长部分患者生存时间，手术切除后放疗可预防局部复发[2]。但由于部分患者出现放疗抵抗等现象，常导致放疗效果不佳[3]，因此，提高肿瘤细胞的放疗敏感性一直是研究者们关注的重点问题。

ZSWIM8-AS1是ZSWIM8基因的反义链转录本，属于长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)。有研究[4]报道，ZSWIM8-AS1在结直肠癌组织中低表达，其低表达与肿瘤大小、临床分期等病理特征密切相关，且其低表达的患者预后不良。LncBase Predicted v.2生物信息学软件预测显示，ZSWIM8-AS1可能与miR-15b靶向结合。有研究[5]显示，miR-15b在结直肠癌组织中高表达，其高表达的患者预后不良，下调其表达可抑制结直肠癌细胞的集落形成、侵袭和迁移能力。本研究以结直肠癌RKO细胞为研究对象，探讨ZSWIM8-AS1对RKO细胞增殖、凋亡、迁移及放射敏感性的影响，并以miR-15b为切入点，探讨ZSWIM8-AS1影响结直肠癌发生发展的分子机制，以期为结直肠癌的靶向分子治疗提供新靶标。

1 对象与方法

1.1 研究对象结直肠癌组织和对应癌旁正常组织(离癌组织>3 cm，且未发现癌细胞)标本源自2017年10月至2019年1月郑州大学第二附属医院首诊并经病理学确诊的25例患者，其中男17例，女8例，年龄46～72岁；高分化5例，中分化9例，低分化11例；淋巴结转移15例，未转移10例。排除标准：①合并其他恶性肿瘤者。②合并心、肾、肝等重要脏器功能障碍者。③合并自身免疫系统疾病者。该研究经医院医学伦理委员会批准同意，患者或其家属签署知情同意书。

1.2 实验细胞和试剂结直肠癌RKO细胞购自中国科学院上海细胞库，胎牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司，RPMI 1640培养基、CCK-8试剂盒和胰蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，反转录试剂盒和PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，Trizol试剂和LipofectamineTM2000试剂盒购自美国Invitrogen公司，PCR引物、ZSWIM8-AS1过表达载体(pcDNA-ZSWIM8-AS1)、空载体(pcDNA)、miR-15b抑制剂(anti-miR-15b)、抑制剂对照序列(anti-miR-NC)、miR-15b模拟物(miR-15b mimics)和模拟阴性序列(miR-NC)购自广州锐博生物科技有限公司，兔抗人Ki-67、活化的Caspase-3(Cleaved Caspase-3)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)、上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)和GAPDH抗体购自Abcam公司，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白检测试剂盒和双荧光素酶活性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.3 组织标本中ZSWIM8-AS1和miR-15b表达水平的qRT-PCR检测采用Trizol试剂提取组织标本中的总RNA，使用微量核酸仪对总RNA纯度和浓度进行检测。参照反转录试剂盒说明书操作合成cDNA，以cDNA为模板，进行q-PCR反应。反应条件：95 ℃10 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。ZSWIM8-AS1正向引物序列：5’-CCGGATCGCATTCACAAAGT-3’，反向引物序列：5’-TGTTTCTCCCAACTGGCTCT- 3’；miR-15b正向引物序列：5’-ATGGCCGATGATAGATGTAC-3’，反向引物序列：5’-CTGGAAGTGCTACACGTGC-3’；GAPDH正向引物序列：5’-GCCATCACAGCAACA CAGAA-3’，反向引物序列：5’-GCCATACCAGTA AGCTTGCC-3’；U6正向引物序列：5’-GTCCGAGAT GTCGAAC-3’，反向引物序列：5’-GTGCCAATGTA AGCTGATAAC-3’。ZSWIM8-AS1以GAPDH为内参，miR-15b以U6为内参，用2-ΔΔCt计算ZSWIM8-AS1和miR-15b相对表达量。

1.4 ZSWIM8-AS1与miR-15b靶向调控关系的双荧光素酶报告实验验证PCR扩增含miR-15b结合位点的ZSWIM8-AS1的3’UTR序列，同时利用基因定点突变技术使结合位点突变，插入pmir GLO荧光素酶载体，分别构建ZSWIM8-AS1野生型荧光素酶载体(ZSWIM8-AS1-WT)和突变型荧光素酶载体(ZSWIM8-AS1-MUT)。RKO细胞接种于6孔板中，每孔1×105个，待细胞融合至60%时，参照LipofectamineTM2000试剂盒说明书，分别将ZSWIM8-AS1-WT、ZSWIM8-AS1-MUT与miR-15b mimic或miR-NC共转染至RKO细胞。转染6 h后，更换培养基，继续培养12 h后，收集细胞。参照双荧光素酶活性检测试剂盒操作说明，检测各组荧光素酶活性。

1.5 细胞转染和分组将RKO细胞接种于含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置于37 ℃、体积分数5 %CO2、97%湿度的培养箱中培养。每1～2 d更换1次新鲜培养基。待细胞融合至80%～90%时，2.5 g/L胰蛋白酶溶液消化，进行传代培养用于后续实验。取传代培养的RKO细胞接种于6孔板中，每孔1×105个。待细胞融合至60%时，参照LipofectamineTM2000试剂盒说明书，将ZSWIM8-AS1过表达载体(pcDNA-ZSWIM8-AS1组)、空载体(pcDNA组)、miR-15b抑制剂(anti-miR-15b组)、抑制剂对照序列(anti-miR-NC组)、ZSWIM8-AS1过表达载体与miR-15b mimics(pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-15b组)、ZSWIM8-AS1过表达载体与模拟阴性序列(pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-NC组)分别转染至RKO细胞。转染6 h后，更换培养基，继续培养12 h后，收集细胞，用于后续实验。

1.6 各组细胞存活率的CCK-8法检测1.5项中各组转染后的细胞接种于96孔板中，每孔1.0×104个，每组设3个复孔。培养24 h后，加10 μL CCK-8，孵育1.5 h后，酶标仪450 nm处测吸光度(A)值，计算细胞存活率。细胞存活率=A实验/A对照×100%。实验重复3次。

1.7 各组细胞凋亡的检测1.5项中各组转染后的细胞接种于24孔板中，每孔2.5×104个，每组设3个复孔。培养24 h后，胰蛋白酶消化，收集细胞。取1.0×106个细胞，加500 μL结合缓冲液重悬，加10 μL Annexin V-FITC，轻轻混合均匀后，避光孵育10 min。再加5 μL PI，轻轻混合均匀后，避光反应5 min，上流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.8 各组细胞迁移情况的Transwell小室检测1.5项中各组转染后的细胞用不含胎牛血清的RPMI 1640培养基调整为5×104个/mL的细胞悬液。Transwell小室置于24孔板中，每组设3个复孔，上室加100 μL细胞悬液，下室加500 μL含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。培养24 h后，40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，4 g/L结晶紫染色15 min，倒置显微镜观察。选取5个视野(×200)，拍照，计数穿膜细胞数。实验重复3次。

1.9 各组细胞的克隆形成实验1.5项中各组转染后的细胞接种于6孔板中，每组设3个复孔，每孔200个，采用美国 Varian 600直线加速器分别以0、2、4、6、8 Gy 6 MV X射线照射，源靶距100 cm，剂量率3.2 Gy/min。照射后，培养箱中培养14 d。取出培养板，吸弃培养基，预冷甲醇固定15 min，结晶紫染色30 min，计数克隆(>50个细胞的集落)，计算细胞克隆形成率(plating efficiency，PE)，PE=(实验组克隆数/对照组克隆数)×100%。计算细胞存活分数(survival fraction，SF)，SF=实验组PE/对照组PE。使用GraphPad Prism 5.0软件，单击多靶数学模型拟合细胞存活曲线，按照公式“SF=1-(1-e-D/D0)N”计算D0。D为照射剂量，N为外推数，Dq为准域剂量，D0为平均致死剂量。计算放射增敏比(SER)。SER=对照组D0/实验组D0。

1.10 各组细胞中Ki-67、Cleaved Caspase-3、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达的Western Blot检测1.5项中各组转染后的细胞接种于24孔板中，每孔2.5×104个，每组设3个复孔。培养箱中培养24 h后，胰蛋白酶消化。RIPA试剂提取细胞总蛋白，BCA蛋白试剂盒检测蛋白含量。取适量蛋白溶液，加1×上样缓冲液混合均匀，100 ℃煮沸5 min，行SDS-PAGE，将分离蛋白电转移至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉液封闭2 h。分别加入Ki-67(按1∶1 000稀释)、Cleaved Caspase-3(按1∶500稀释)、N-cadherin(按1∶1 000稀释)、E-cadherin(按1∶1 000稀释)和GAPDH(按照1∶1 000稀释)一抗，4 ℃孵育12 h。TBST洗膜3次，5 min/次。加入山羊抗兔二抗(按照1∶2 000稀释)，室温孵育1 h。TBST洗膜3次，5 min/次。加入化学发光试剂，避光显影后凝胶成像系统曝光拍照。以GAPDH为内参，Image J软件分析蛋白条带灰度值。以目的蛋白和内参GAPDH条带灰度值的比值表示目的蛋白表达水平。实验重复3次。

1.11 统计学处理采用SPSS 22.0对实验数据进行分析。应用配对资料的t检验比较结直肠癌和癌旁组织中ZSWIM8-AS1和miR-15b表达的差异，应用两独立样本的t检验比较不同处理组和相应对照组RKO细胞中ZSWIM8-AS1和miR-15b表达、细胞存活率、凋亡率迁移细胞数以及Ki-67、Cleaved Caspase-3、E-cadherin和N-cadherin蛋白表达的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 结直肠癌和癌旁组织中ZSWIM8-AS1和miR-15b的表达见表1。与癌旁组织比较，结直肠癌组织中ZSWIM8-AS1表达降低(P<0.05)，miR-15b表达升高(P<0.05)。

表1 结直肠癌和癌旁组组织中ZSWIM8-AS1和miR-15b的表达

2.2 ZSWIM8-AS1与miR-15b靶向关系的双荧光素酶报告实验验证结果LncBase Predicted v.2靶基因在线软件预测显示的ZSWIM8-AS1与miR-15b的结合位点见图1。验证结果见表2：与共转染WT-ZSWIM8-AS1和miR-NC组比较，共转染WT-ZSWIM8-AS1和miR-15b组细胞荧光素酶活性降低(P<0.05)；而与共转染MUT-ZSWIM8-AS1和miR-NC组比较，共转染MUT-ZSWIM8-AS1和miR-15b组细胞荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)；表明ZSWIM8-AS1可与miR-15b靶向结合。

图1 ZSWIM8-AS1与miR-15b核苷酸序列的结合位点

表2 双荧光素酶活性检测结果(n=9)

2.3 各组RKO细胞中ZSWIM8-AS1和miR-15b表达水平的比较见表3。与pcDNA组比较，pcDNA-ZSWIM8-AS1组pcDNA-ZSWIM8-AS1组细胞中ZSWIM8-AS1表达升高(P<0.05)，miR-15b表达降低(P<0.05)；与anti-miR-NC组比较，anti-miR-15b组细胞中miR-15b表达降低(P<0.05)。与pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-NC组比较，pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-15b组细胞中miR-15b表达升高(P<0.05)。

表3 各组RKO细胞中ZSWIM8-AS1和miR-15b表达的比较(n=9)

2.4 各组RKO细胞存活率、凋亡率和迁移细胞数的比较见图2、表4。与pcDNA组比较，pcDNA-ZSWIM8-AS1组细胞存活率和迁移数降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)。与anti-miR-NC组比较，anti-miR-15b组细胞存活率和迁移数降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)。与pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-NC组比较，pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-15b组细胞存活率和迁移数升高(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)。

A：pcDNA组；B：pcDNA-ZSWIM8-AS1组；C：anti-miR-NC组；D：anti-miR-15b组；E：pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-NC组；F：pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-15b组

表4 各组RKO细胞存活率、凋亡率、迁移细胞数的比较( n=9)

2.5 各组RKO细胞放射敏感性结果与pcDNA组比较，pcDNA-ZSWIM8-AS1组细胞SF降低(P<0.05)，增敏比为1.747。与anti-miR-NC组比较，anti-miR-15b组细胞SF降低(P<0.05)，增敏比为1.977。与pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-NC组比较，pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-15b组细胞SF升高(P<0.05)，增敏比为0.645。详见表5。

表5 各组RKO细胞放射生物学相关参数

2.6 各组RKO细胞中Ki-67、Cleaved Caspase-3、E-cadherin和N-cadherin蛋白表达比较见图3、表6。与pcDNA组比较，pcDNA-ZSWIM8-AS1组细胞中Ki-67和N-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3和E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)。与anti-miR-NC组比较，anti-miR-15b组细胞中Ki-67和N-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3和E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)。与pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-NC组比较，pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-15b组细胞中Ki-67和N-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)，Cleaved Caspase-3和E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)。

1：pcDNA组；2：pcDNA-ZSWIM8-AS1组；3：anti-miR-NC组；4：anti-miR-15b组；5：pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-NC组；6：pcDNA-ZSWIM8-AS1+miR-15b组

表6 各组RKO细胞中Ki-67、Cleaved Caspase-3、E-cadherin和N-cadherin的蛋白表达水平比较(n=9)

3 讨论

lncRNA可在转录、转录后和表观遗传等多个方面参与调控细胞增殖、迁移和侵袭等生命过程，可作为肿瘤等多种疾病治疗的分子靶点。研究已表明，HOTAIR[6]、TINCR[7]和DSCAM-AS1[8]等多个lncRNA在结直肠癌中表达升高，作为促癌基因参与结直肠癌的发生发展；而TUBA4B[9]和B3GALT5-AS1[10]等lncRNA在结直肠癌中表达降低，其过表达抑制结直肠癌的发生发展。ZSWIM8-AS1是近年来新发现的一种lncRNA，其在结直肠癌中的作用尚未明确。

本研究结果显示，结直肠癌组织中ZSWIM8-AS1的表达明显低于对应的癌旁组织，与相关报道[4]结果一致，提示ZSWIM8-AS1可能作为抑癌基因参与结直肠癌的发生发展；通过过表达结直肠癌细胞中ZSWIM8-AS1的表达发现，过表达ZSWIM8-AS1可降低结直肠癌细胞的增殖和迁移能力，而促进细胞凋亡，提示ZSWIM8-AS1有可能成为结直肠癌治疗的分子靶点。放疗抵抗是结直肠癌放疗失败的主要原因，增强肿瘤细胞对放射线的敏感性可提高放疗疗效，改善患者预后[11]。本研究结果还显示，过表达ZSWIM8-AS1的结直肠癌细胞经放射线照射后，存活分数降低，增敏比为1.747，表明过表达ZSWIM8-AS1可增强结直肠癌细胞对放射线的敏感性。

细胞增殖紊乱和凋亡受阻是肿瘤发病的重要机制之一，诱导肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤的重要策略[12]。Ki-67是在细胞增殖中表达的一种核抗原，其表达水平升高时细胞的增殖活性也随之升高[13]。Caspase级联反应参与调控细胞凋亡，其中Caspase-3是Caspase级联反应的关键调控分子，其被活化后诱导细胞凋亡[14]。本研究结果显示，过表达ZSWIM8-AS1抑制了结直肠癌细胞中Ki-67蛋白表达，而促进了Cleaved Caspase-3蛋白表达，提示过表达ZSWIM8-AS1可能通过调控细胞中Ki-67蛋白表达及Caspase-3的活化来抑制结直肠癌细胞增殖、促进其凋亡。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是具有极性的上皮细胞转换成为具有移行能力的间质细胞并获得侵袭和迁移能力的过程，与恶性肿瘤的发生发展及转移密切相关[15]。EMT发生时，上皮标志物E-cadherin表达降低，而间质标志物N-cadherin表达升高。本研究显示，过表达ZSWIM8-AS1抑制结直肠癌细胞中N-cadherin蛋白表达，而促进E-cadherin蛋白表达，提示过表达ZSWIM8-AS1可能通过抑制EMT过程来抑制结直肠癌细胞迁移。

为了进一步探究ZSWIM8-AS1影响结直肠癌细胞恶性表型及放射敏感性的分子机制，本研究证实了ZSWIM8-AS1可与miR-15b靶向结合，其过表达ZSWIM8-AS1抑制结直肠癌细胞中miR-15b的表达。miR-15b在多种肿瘤中异常表达，参与肿瘤发生发展。有研究报道，miR-15b在透明细胞肾细胞癌[16]、肺腺癌[17]和乳腺癌[18]组织中表达升高，降低其表达可抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭及EMT过程；而miR-15b在胃癌[19]、卵巢癌[20]、肝细胞癌[21]和胶质瘤[22]等肿瘤组织中表达降低，发挥抑癌基因作用。这说明miR-15b在不同肿瘤中发挥的作用不同。本研究显示，miR-15b在结直肠癌组织中呈高表达，下调其表达可抑制结直肠癌细胞增殖和迁移，并诱导细胞凋亡，增强细胞对放射线敏感性，增敏比为1.977，说明miR-15b作为促癌基因参与结直肠癌的发生发展。本研究还显示，过表达miR-15b逆转了过表达ZSWIM8-AS1对RKO细胞增殖、凋亡、迁移及放射敏感性的影响，提示过表达ZSWIM8-AS1可能通过负调控miR-15b来抑制RKO增殖和迁移，并诱导细胞凋亡及增强细胞放射敏感性。

综上所述，ZSWIM8-AS1在结直肠癌组织中呈低表达，而miR-15b呈高表达，过表达ZSWIM8-AS1可抑制结直肠癌细胞RKO增殖和迁移，促进细胞凋亡及对放射线的敏感性，其作用机制与靶向负调控miR-15b有关，ZSWIM8-AS1/miR-15b轴可能为结直肠癌的治疗提供了新靶标。