三黄凝胶对大鼠耳廓痤疮模型核因子-κB和白细胞介素-37的影响

牛凡琪，郭斐斐，牛凡红，刘婧，王思农

（甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000）

痤疮是临床上的常见病[1]之一，发病机制复杂，研究认为痤疮丙酸杆菌高度表达而诱发炎性反应[2]。一方面，核因子（NF）-κB 信号通路[3]的表达被激活或是抑制已成为炎性反应发生不同进展的重要因素；另一方面，抗炎细胞因子白细胞介素（IL）-37[4]通过高水平表达抑制炎性反应[5]，在炎性反应中起着不可替代的作用。本研究以酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测外用三黄凝胶的大鼠耳廓痤疮模型中NF-κB和抗炎细胞因子IL-37活性表达情况，探讨三黄凝胶治疗痤疮的机制[6]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 甘肃中医药大学实验动物中心提供的SPF级Wistar大鼠60只，人工喂养6～8周，体质量（200±20）g，雌性∶雄性=1∶1。实验动物许可证号：SCXK（甘）2015-001。

1.1.2 药物和试剂 甘肃中医药大学附属医院提供三黄凝胶（含3.6 g生药/10 g）作为治疗组的药物。对照组的药物：重庆华邦制药股份有限公司提供0.025%维A酸乳膏（批次：H50021817）；天津市富宇精细化工有限公司提供100%油酸（批次：101212）；上海中乔新舟生物科技有限公司提供大鼠血清NF-κB试剂盒（批次：EK0531）和大鼠血清IL-37试剂盒（批次：EK0837）。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 选择60只Wistar健康大鼠，采用随机抽样法分6组：空白组和模型组、阳性对照组以及三黄凝胶低浓度组、中浓度组、高浓度组，每组10只，除空白组，其余组建立大鼠耳廓复合痤疮模型[7]，即在各组大鼠的右侧耳廓开口处均匀外抹100%油酸，0.5 mL/次，1次/d，给药 3 周，采用随机抽样法从模型组选择2只大鼠，在无菌实验室将大鼠的耳朵剪下，使用HE染色法处理皮损组织，观察病理。光镜下观察到：增厚严重的角质层，扩张的毛囊和过度角化，并且角化皮损见于毛囊口、漏斗部，以及堵塞的角栓塞，壶状似的扩大和消失的皮脂腺，然后参照痤疮组织学判定（实验性）分级标准[8]：毛囊漏斗部无粉刺（－）；少量的密集角化皮损见于毛囊漏斗部（+）；中等量的角化皮损见于毛囊漏斗部，延伸至皮脂腺（2+）；广泛角化皮损（和人的开放性痤疮皮损类似）见于扩张毛囊内（3+）。（+）～（3+）提示大鼠耳廓的痤疮模型已形成。

1.2.2 动物分组、给药 在造模完成后，开始涂抹药物。使用人和大鼠之间换算公式计算用药剂量。给大鼠的用药剂量为：0.025%维A酸乳膏给予阳性对照组[5 g/（kg·d）]（和换算公式计算结果一致）；给药[0.08 g生药/（kg·d）]（换算公式计算结果的2倍）于三黄凝胶高浓度组；给药［0.04 g生药/（kg·d）］（和换算公式计算结果一致）于三黄凝胶中浓度组；给药[0.02 g生药/（kg·d）]（换算公式计算结果的1/2倍）于三黄凝胶低浓度组。在大鼠的右耳廓造模处给药，1次/d，给药4周，于空白组和模型组不给药。

1.3 肉眼、组织病理学观察 每天观察、记录每组大鼠耳处造模以及用药治疗后的皮肤症状，最后一次外用药24 h后，在无菌实验室使用工具剪掉所有组的鼠耳，HE染色处理后，可以通过光镜来观察组织病理学变化。

1.4 NF-κB和抗炎细胞因子IL-37活性表达水平的检测 在给药结束后经过24 h，采集所有大鼠心脏血，通过离心、分离技术处理血清（放置-80℃环境下，使用ELISA法检测NF-κB和抗炎细胞因子IL-37活性表达水平。）

1.5 统计学分析 通过SPSS 25.0统计软件对实验数据进行处理、分析，均数±标准差表示定量资料，单因素方差分析比较组间均数，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2 结果

2.1 观察造模前后皮损情况 见图1。

图1 使用药物治疗后的4组和未使用药物的2组鼠耳皮肤

空白组：鼠耳部皮肤未发生明显改变，与正常组织基本一致；颜色粉红，质地很柔软，毛细血管清晰可见。大鼠的内耳开口处：皮肤平滑，未见角化物质和粉刺、红肿。

模型组：观察1周，大鼠耳部颜色微微变红，可见许多扩张的毛细血管，变硬、增厚的表皮。观察2周，鼠耳皮肤变红肿，皮温比空白组稍高，鼠耳表皮粗糙、增厚，有脱屑、结痂现象。第3周，耳部皮肤比第2周红肿更甚，皮温也升高明显，质地干燥、粗糙，表皮也增厚显著，脱屑和结痂的情况有所加重，可见隆起的丘疹。

2.2 治疗后大鼠耳的皮损变化情况 使用药物治疗1周后，各治疗组的鼠耳皮肤：小范围的症状逐渐好转，颜色略红，柔软质地，薄薄的表皮，结痂掉落，皮肤触之无灼热感。在给药3周后，观察三黄凝胶高浓度组的大鼠耳廓情况：局部触之柔软和光滑，颜色正常、表皮皮温正常，没有肿胀、脱屑、结痂。观察三黄凝胶的低浓度组、中浓度组、阳性对照组，和模型组相比：皮损症状有了明显的改善。肉眼观察模型组，皮损没有明显的好转；空白组没有明显的变化。

2.3 观察组织、病理情况 见图2。

图2 染色处理后的鼠耳病理（HE染色×100）

空白组：大鼠耳部的表皮层：厚薄适中，可清晰看见毛囊和真皮以及表皮界限，还可见真皮层有炎性细胞存在，其他没有明显变化。

模型组：在造模完成后，增厚的角质层和纤维组织、过度的角化、粗大的毛囊。广泛角化物质见于毛囊口、漏斗部；同时观察到：角栓塞形成、像壶状样扩大、皮脂腺的消失，并且可见炎性细胞的浸润，和血管增厚的纤维组织。

阳性对照组：和模型组相比：可见变薄的纤维层，以及浸润的炎性细胞、血管数量大幅度降低。

三黄凝胶组：与模型组对比，当药物浓度不断增加的情况下，存在角质层、纤维组织厚度渐渐变薄的现象，还有炎性细胞和血管数量同时减少。

2.4 对比各组的鼠耳廓痤疮模型与空白组的NF-κB和IL-37活性表达情况

2.4.1 NF-κB在模型组中表达水平升高显著，差异有统计学意义（F=194.650，P＜0.05）。对比模型组，在三黄凝胶低浓度、中浓度、高浓度组和阳性对照组中，NF-κB活性表达水平都有不同程度的降低，差异有统计学意义（F=194.650，P＜0.05）。对比阳性对照组，在三黄凝胶低浓度、中浓度组中NF-κB活性表达水平相差无几，差异无统计学意义（F=194.650，P＞0.05）。三黄凝胶高浓度组的NF-κB活性表达水平显著降低，差异有统计学意义（F=194.650，P＜0.05）。

2.4.2 对比空白组，IL-37在模型组中表达水平升高显著，差异有统计学意义（F=192.090，P＜0.05）。对比模型组，在阳性对照组和三黄凝胶高浓度、中浓度、低浓度组中，IL-37水平都有明显降低，差异有统计学意义（F=192.090，P＜0.05）。三黄凝胶中浓度、低浓度组和阳性对照组中IL-37水平相近，差异无统计学意义（F=192.090，P＞0.05）。三黄凝胶高浓度组比阳性对照组中IL-37水平降低明显，差异有统计学意义（F=192.090，P＜0.05）。

根据数据水平、病理和肉眼观察比较，可以得出：三黄凝胶可以降低大鼠的NF-κB和IL-37活性表达水平，见表1。

表1 对比每组鼠耳粉刺模型NF-κB和IL-37 含量 （pg/mL，±s）

表1 对比每组鼠耳粉刺模型NF-κB和IL-37 含量 （pg/mL，±s）

注：NF-κB 中，a示与空白组比较，P 分别是 0.000、0.000、0.000、0.000、0.000；b示与模型组比较，P 分别是 0.000、0.000、0.000、0.000；c示与阳性对照组比较，P 分别是 0.903、0.951、0.000；IL-37 中，d示与空白组比较，P 分别是 0.000、0.000、0.000、0.000、0.000；e示与模型组比较，P 分别是 0.000、0.000、0.000、0.000；f示与阳性对照组比较，P分别是 0.777、0.782、0.000。

组别 n NF-κB IL-37空白组 10 22.95±1.78 15.34±2.11模型组 10 48.18±2.04a 39.91±1.44d阳性对照组 10 33.28±2.00ab 25.30±1.77de低浓度组 10 33.18±1.93abc 25.53±2.14def中浓度组 10 33.23±1.80abc 25.53±1.51def高浓度组 10 28.91±1.75abc 20.41±2.11def F 194.650 192.090 P 0.000 0.000

3 讨论

痤疮与皮肤的特发性炎性反应密切相关，炎性因子IL-1、IL-6、IL-8的高水平表达可导致瘢痕的形成[9-11]。NF-κB是一种调节多种炎性反应表达的诱导性转录因子[12]，是联系炎性反应的关键信号分子。肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-6、IL-8[13]等至少 27种不同炎性反应靶基因可以被NF-κB激活，进而产生大量中性粒细胞浸润、聚积于炎性反应部位，比如一氧化氮炎性效应分子[14]。此外，NF-κB可以刺激IL-1β、TNF-α等细胞因子表达，并且细胞因子还可以刺激NF-κB，进一步使NF-κB活化，让炎性反应持续、放大[15]。同时，IL-37是新发现的抗炎细胞因子，由巨噬细胞刺激炎性细胞因子时产生，抑制炎性细胞因子的激活，在痤疮中起到抑制炎性反应的作用[16]。IL-37在正常情况下呈低水平表达，在痤疮模型中炎性因子的作用下水平迅速升高，发挥作用，抑制炎性反应[17]。IL-37通过降低IL-1α、IL-6、IL-1β、干扰素（IFN）-γ、IL-18、TNF-α 的水平来控制炎性反应的发展[18]。

根据痤疮组织学判定（实验性）分级标准建立大鼠耳廓痤疮模型，当造模的鼠耳廓皮肤、病理学变化与人的痤疮皮损基本一致，则说明了痤疮模型造模的可行性。“三黄膏”常用于治疗痤疮，药物组成：黄连、黄芩、黄柏、凡士林、芝麻油。实验中的三黄凝胶在“三黄膏”基础上结合现代技术进行剂型转变，以原来药物为基础，利用现代制作工艺，以卡波姆940作为基质，另外增加丹参、当归、苦参、白及、冰片、白芷、茯苓和薄荷，将多余的色素脱去，添加（月桂氮酮）促透剂和（三乙醇胺）调节剂制作成三黄凝胶。在多年的临床应用中，观察发现三黄凝胶在治疗中、重度痤疮方面有显著疗效[19]，能直达病位，和皮肤耦合的效果也极佳，有吸收药物快、作用时间长、明显改善局部皮损的优点。清热消肿是黄芩、黄柏、黄连（可以减少炎性细胞因子的释放）共同的功效；当归能显著修复皮肤创面，还有抗炎作用，并能降低毛细血管的通透性，使前列腺素E2（PGE2）生成减少，减轻皮肤局部炎性反应[20-21]；丹参可以促进组织修复、再生，皮肤局部微循环得到调节，成纤维细胞的生长得到抑制；此外，创伤性炎性反应范围可以被丹参通过免疫调节控制在适宜范围之内，加快修复破坏组织。

此研究证实，大鼠的耳廓痤疮模型中NF-κB和IL-37活性表达水平能够被三黄凝胶显著降低。三黄凝胶的低浓度、中浓度组和阳性对照组的治疗效果基本相同，三黄凝胶的高浓度组比阳性对照组的治疗效果更好。因而推断：三黄凝胶高浓度组通过降低抗炎细胞因子IL-37水平，并抑制NF-κB的活性表达，从而减少了NF与对应炎性反应的靶向基因结合、表达，起到治疗炎性反应的效果。