西花蓟马GABA受体基因鉴定及FoRDL在多杀霉素抗性中的作用

王 京, 何秉青, 华登科, 张 坤, 袁江江, 郑晓斌,徐宝云, 张友军, 吴青君,*

(1. 中国农业科学院蔬菜花卉研究所, 北京 100081; 2. 北京市昌平区农业技术推广站, 北京 102200)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是动物神经系统中一种重要的神经递质，通过与位于突触后膜的受体结合，使突触后神经元处于保护性抑制状态(Bown and Shelp, 1997; Ashbyetal., 2012)。昆虫的GABA受体(GABA receptors, GABAR)按其结构特征和药理学性质可分为离子型受体(GABAAR)和代谢型受体(GABABR)两类。GABAAR是一个由5个亚基组成的寡聚体蛋白(Chebib and Johnston, 2000)，昆虫的GABAAR是环戊二烯类、苯基吡唑类以及大环内酯类杀虫剂的分子靶标(Buckinghametal., 2005; Rahmanetal., 2012; Nakaoetal., 2015)，目前已知有3类亚基：抗狄氏剂亚基(resistance to dieldrin, RDL)(Ffrench-Constantetal., 1991)、配体门控氯离子通道同系物3(ligand-gated chloride channel homologue 3, LCCH3)(Hendersonetal., 1993)和果蝇的GABA和甘氨酸类似受体(GABA and glycine-like receptor ofDrosophila, GRD)(Harveyetal., 1994)。RDL亚基最初得名于黑腹果蝇Drosophilamelanogaster，因其与环戊二烯类杀虫剂狄氏剂抗性形成相关(Ffrench-Constantetal., 1991)，随后发现该亚基也在昆虫对阿维菌素和氟虫腈抗性中起重要作用(Guillemaudetal., 2003; Weietal., 2015; Mengetal., 2019)。GABABR属于G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor)家族，该受体通过G蛋白介导连接第二信使，调节控制神经细胞内环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)含量，通过cAMP与细胞内的K+和Ca2+通道相偶联，进行信号转导(Kuriyamaetal., 2000; Labouèbeetal., 2007)。

西花蓟马Frankliniellaoccidentalis是一种重要的世界性农业害虫(Kirk and Terry, 2003)，目前，使用杀虫剂是防治西花蓟马的主要手段，但其不合理使用导致西花蓟马的抗药性问题日趋严重(Demirozeretal., 2012; Gaoetal., 2012; 万岩然等, 2016)。 据Arthropod Pesticide Resistance Database(Sanches and Wise, 2021)最新统计，西花蓟马已对包括多杀霉素类药剂在内的至少7类药剂产生了抗性。多杀霉素是一种大环内酯类生物源农药(Williamsetal., 2003)，主要作用于昆虫的烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR)(Salgado, 1997)，GABAAR可能是其次要靶标(Watson, 2001)。已有研究表明西花蓟马等多种昆虫对多杀霉素的高水平抗性与nAChR的α6亚基变异密切相关(Puineanetal., 2013; Silvaetal., 2016; Wanetal., 2018)，但作为靶标之一的GABAAR是否在西花蓟马对多杀霉素抗性形成中起作用尚未见报道。

本研究基于本实验室西花蓟马的基因组和转录组数据(未发表)，首先对西花蓟马GABAAR和GABABR基因进行了鉴定、克隆验证以及生物信息学分析；为探究GABAAR是否参与西花蓟马对多杀霉素的抗性，进一步比较了西花蓟马多杀霉素敏感和抗性品系中GABAAR亚基基因FoRDL,FoLCCH3和FoGRD的序列和表达差异，利用RNAi结合生物测定，研究FoRDL在西花蓟马对多杀霉素抗性中的作用。研究结果将有助于了解西花蓟马GABAR家族基因，为GABAR基因功能研究提供参考，为阐明西花蓟马对多杀霉素的抗性机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

西花蓟马多杀霉素敏感品系(Ivf03)和抗性近等基因系品系(NIL-R)是通过多世代回交法建立(Yuanetal., 2017)。NIL-R对多杀霉素的抗性倍数为36 000倍(Yuanetal., 2017)。Ivf03使用新鲜四季豆Phaseolusvulgaris饲喂，不接触任何杀虫剂。养虫室温度为27±1℃，相对湿度为65%，光周期为16L∶8D(Zhangetal., 2007)。NIL-R用2.5%多杀霉素悬浮剂(SC)(spinosad, 美国陶氏益农公司)处理的四季豆饲喂(侯文杰等, 2013)，饲养条件与敏感品系一致。

1.2 GABAR家族基因的鉴定

从黑腹果蝇基因组数据库和GenBank中下载黑腹果蝇和意大利蜜蜂Apismelliferaligustica的GABAR家族基因蛋白序列，并以其为参照，对本实验室西花蓟马基因组进行GABAR家族基因检索。然后以本实验室西花蓟马转录组序列为参照，对预测到的西花蓟马GABAR家族基因序列进行校正，同时在NCBI nr数据库中用BLASTX的方法进行序列比对。根据本实验室西花蓟马基因组，查询8个GABAR基因所在染色体及其位置，使用在线工具MG2C(http:∥mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)对西花蓟马GABAR基因进行染色体定位分析。

1.3 GABAR家族基因的克隆及测序

采用Trizol(Trizol®Reagent RNA Extraction Kit, Invitrogen)法分别提取Ivf03和NIL-R品系 3日龄成虫总RNA，经琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000对RNA的完整性、浓度和纯度进行检测，使用cDNA合成试剂盒(PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit, TaKaRa)分别合成cDNA。根据1.2节获得的GABAR家族基因序列信息设计引物(表1)，根据Q5超保真聚合酶(New England BioLabs)说明书分别进行PCR扩增。 PCR反应体系(25 μL): 5×Q5 Reaction Buffer 5 μL, dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL, Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.25 μL, 5×Q5 High GC Enhancer(Optional)5 μL, Nuclease-Free Water 11.25 μL。PCR反应程序: 98℃ 30 s; 98℃ 10 s, 60℃ 30 s, 72℃ 90 s～4 min, 30个循环; 72℃ 10 min。PCR扩增产物送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 生物信息学分析

采用MEGA6.0软件邻接法(neighbor-joining method)(Tamuraetal., 2013)对1.3节克隆验证的西花蓟马GABAR基因构建系统进化发育树，bootstrap值设为1 000。通过NCBI数据库下载膜翅目、鞘翅目、双翅目、鳞翅目、同翅目和缨翅目等其他物种的GABAR基因，选取黑腹果蝇、二化螟Chilosuppressalis和东亚飞蝗Locustamigratoria的nAChR基因作为外围参照基因。利用Meme在线程序(http:∥meme-suite.org/tools/meme)对西花蓟马GABAR蛋白保守功能基序(motif)进行分析。使用ExPASy(Gasteigeretal., 2003)和PSORT(Tamura and Akutsu, 2007)工具对西花蓟马的GABAR基因所编码蛋白质的氨基酸数目、分子量、等电点、带负电荷的残基总数(Asp+Glu)、带正电荷的残基总数(Arg+Lys)、不稳定指数(instability index)、脂肪族氨基酸指数(aliphatic index)和亲疏水性进行分析以及对蛋白的亚细胞定位进行预测。采用DANMAN软件对Ivf03和NIL-R品系克隆获得的FoRDL, FoLCCH3和FoGRD基因序列进行比对，同时以已知黑腹果蝇、意大利蜜蜂和赤拟谷盗Triboliumcastaneum相应基因序列为参照。利用软件ClustalW2(http:∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)进行基因序列相似性分析，使用在线软件SignalP(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽预测，采用TMHMM软件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行蛋白质跨膜区域预测。

1.5 GABAAR亚基基因的表达动态

利用qPCR技术测定Ivf03品系不同发育阶段(1-2龄若虫、蛹和3日龄成虫)和NIL-R品系3日龄成虫的FoRDL,FoLCCH3和FoGRD相对表达量。在解剖镜下用解剖针将若虫、蛹和成虫分别挑至1.5 mL离心管中，样品收集后立即置于液氮中冷冻，提取总RNA，cDNA合成方法同1.3节。FoRDL的定量引物参照Meng等(2018)，FoLCCH3和FoGRD的定量引物采用Primer Premier 5.0设计(表1)。qPCR在 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System上进行，反应体系(20 μL): 2×FastFire qPCR PreMix(SYBR Green)10 μL, cDNA模板1 μL, 正反向引物(10 pmol/μL)各0.6 μL, 50×ROX Reference Dye 0.4 μL, RNase-Free ddH2O 7.4 μL。反应程序: 95℃ 10 min; 95℃ 15 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s, 40个循环。选择琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase, SDHA)和β-肌动蛋白(β-actin)基因作为内参基因(Cifuentesetal., 2012)，以两个内参基因Ct值的几何平均值校正目的基因的表达水平(Vandesompeleetal., 2002)，采用2-ΔΔCt计算基因的相对表达量。每个虫态设置4个生物学重复，每个生物学重复1-2龄若虫和蛹约200头，成虫约100头；每个生物学重复设置4个技术重复。

1.6 FoRDL的RNAi

根据1.5节定量测定的结果，FoLCCH3和FoGRD的表达量在敏感和抗性品系中无显著差异，而FoRDL在抗性品系中表达量显著低于敏感品系，因此对FoRDL进行了RNAi实验。使用 T7 RiboMAX Express RNAi试剂盒(Promega, Madison, WI美国)，按照说明书合成dsFoRDL(处理组)和dsEGFP(对照组)，引物序列见表1。取敏感品系西花蓟马3日龄成虫约50头置于干扰装置内，采用饲喂法进行干扰，具体操作方法参照袁江江等(2018)。分别在干扰12, 24, 36, 48和72 h后收集样品，检测沉默效率。处理组和对照组均设置4个生物学重复，每个生物学重复为50头成虫；每个重复设置4个技术重复。FoRDL的表达量的检测方法参照1.5节。采用叶管药膜法(龚佑辉等, 2010; 王泽华等, 2011)收集处理组和对照组干扰24 h存活的成虫，使用含有0.1%曲拉通X-100的蒸馏水将2.5%多杀霉素分别配制成0.250和0.400 mg/L两个浓度，药剂处理48 h后分别统计并计算处理组和对照组的死亡率。处理组和对照组均设计10个重复，每个重复处理约20头成虫。

1.7 数据分析

采用SPSS Statistics 19软件对实验数据进行统计分析。采用独立样本t检验对FoRDL,FoLCCH3和FoGRD在西花蓟马敏感和抗性品系中的表达量以及RNA干扰FoRDL后基因相对表达量和成虫死亡率差异进行分析；采用单因素方差分析及最小显著差法(LSD)分析FoRDL,FoLCCH3和FoRGD在不同发育阶段的相对表达量差异显著性。

2 结果

2.1 西花蓟马GABAR家族基因鉴定及生物信息学特征

克隆获得8个GABAR基因FoRDL,FoLCCH3,FoGRD,FoGRD-like1,FoGRD-like2,FoB1,FoB2和FoB-like(GenBank登录号: MH148151-MH148158)的全长序列，ORF长度介于1 080～3 720 bp之间，包括5个GABAAR亚基基因和3个GABABR基因，分布于6条染色体上，其中FoLCCH3,FoGRD和FoGRD-like2分布在3号染色体上，FoGRD-like1,FoB2,FoB-like,FoB1和FoRDL依次分布在6, 7, 10, 13和14号染色体上(图1)。

图1 西花蓟马GABAR基因在染色体上的分布Fig. 1 Distribution of GABAR genes on chromosomes of Frankliniella occidentalis

8个GABAR基因所编码的氨基酸数目介于360～1 240之间，所编码的蛋白分子量介于41.88～137.84 kD之间，等电点介于8.04～9.62之间，表明这8个蛋白呈碱性。此外，蛋白带负电荷的残基总数范围为33～138，带正电荷的残基总数范围为44～141，不稳定指数范围为37.81～49.75，脂肪族氨基酸指数范围为73.18～97.81；除FoRDL和FoB-like为疏水性蛋白质，其余的均为亲水性蛋白质。亚细胞定位预测分析表明，所有GABAR蛋白均分布在内质网。

2.2 西花蓟马GABAR基因系统进化树

由系统进化分析可知，西花蓟马8个GABAR基因与其他昆虫物种相对应的GABAR基因聚类，具有很高的保守性。西花蓟马GABAR不同基因的亲缘关系不同：对于RDL亚基，西花蓟马所属的缨翅目与膜翅目昆虫的亲缘关系较近，而与鳞翅目昆虫的亲缘关系较远(图2)；对于LCCH3亚基，西花蓟马与等翅目白蚁Cryptotermessecundus亲缘关系较近，与膜翅目丽蝇蛹集金小蜂Nasoniavitripennis亲缘关系较远(图2)；对于GRD亚基，西花蓟马与双翅目果蝇Drosophilanavojoa亲缘关系较近，FoGRD-like1和FoGRD-like2与鳞翅目玉米螟Ostriniafurnacalis亲缘关系较近(图2)；对于B亚基，西花蓟马的B1和B2亚基均与同属蓟马科的棕榈蓟马Thripspalmi亲缘关系最近(图2)。

图2 邻接法构建的基于氨基酸序列的昆虫GABAR蛋白系统进化树(1 000次重复)Fig. 2 Phylogenetic tree of insect GABAR proteins based on amino acid sequences by neighbor-joining method (1 000 replicates)GABAR蛋白来源物种Origin species of GABAR proteins: Fo: 西花蓟马Frankliniella occidentalis; Dm: 黑腹果蝇Drosophila melanogaster; Md: 家蝇Musca domestica; Cc: 实蝇Ceratitis capitata; Zc: 瓜实蝇Zeugodacus cucurbitae; Dn: Drosophila navojoa; Lc: 铜绿蝇 Lucilia cuprina; Tc: 赤拟谷盗Tribolium castaneum; Fa: 阿里山潜蝇茧蜂 Fopius arisanus; Am: 意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica; Nv: 丽蝇蛹集金小蜂Nasonia vitripennis; Ob: 双角壁蜂Osmia bicornis; Bm: 家蚕Bombyx mori; Bma: 野桑蚕Bombyx mandarina; Px: 小菜蛾Plutella xylostella; Sl: 斜纹夜蛾Spodoptera litura; Aa: 黑斑蚊Aedes aegypti; Ld: 马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata; Cfe: 猫栉头蚤Ctenocephalides felis; Of: 亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis; Pp: 萤火虫Photinus pyralis; Dv: 西方玉米根虫Diabrotica virgifera; Sfl: 蔗黄伪毛蚜Sipha flava; Nf: 黄褐尼氏蚁Nylanderia fulva; Bl: 锈腹实蝇Bactrocera latifrons; Cs: 白蚁Cryptotermes secundus; Ac: 中华蜜蜂Apis cerana; Mp: 法老小家蚁Monomorium pharaonis; Da: 嗜凤梨果蝇Drosophila ananassae; Tpr: 短管赤眼蜂Trichogramma pretiosum; Sf: 草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda; Ha: 茄夜蛾Helicoverpa armigera; Dp: 黑脉金斑蝶Danaus plexippus; Tp: 棕榈蓟马Thrips palmi; Pa: 美洲大蠊Periplaneta americana; Cf: 多胚跳小蜂Copidosoma floridanum; Cl: 温带臭虫Cimex lectularius; Dq: 方头恐猛蚁Dinoponera quadriceps; Wa: 金刻沃氏蚁Wasmannia auropunctata; Obr: 锯针蚁Odontomachus brunneus; Ve: 扁胸切叶蚁Vollenhovia emeryi; Si: 红火蚁Solenopsis invicta; Tz: 皱切叶蚁Trachymyrmex zeteki; Cco: 驼切叶蚁Cyphomyrmex costatus; Ae: 顶切叶蚁Acromyrmex echinatior; Ace: 六刺芭切叶蚁Atta cephalotes; Ld: 马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata; At: 小蜂窝甲虫Aethina tumida; Nl: 稻褐飞虱Nilaparvata lugens; Dno: 汗蜂Dufourea novaeangliae; Ah: 小斑草眼蝶Aphantopus hyperantus; Cse: 白蚁Cryptotermes secundus; Obi: 毕氏卵角蚁Ooceraea biroi; Csu: 毕氏卵角蚁Ooceraea biroi; Lm: 飞蝗Locusta migratoria.

通过motif分析和进化树聚类结果可知，西花蓟马GABAAR和GABABR氨基酸序列均存在高度一致性。西花蓟马GABAAR亚基FoGRD, FoGRD-like1和FoGRD-like2聚类在一起，FoRDL和FoLCCH3聚类在一起，这5个亚基氨基酸序列的保守基序类型、排序均一致。GABABR亚基FoB1, FoB2和FoB-like氨基酸序列的保守基序一致，但是FoB2在其蛋白质后端又分布4个Motif 8保守基序(图3)。

图3 西花蓟马GABAR基因保守功能基序分析Fig. 3 Analysis of conserved motifs of GABAR genes in Frankliniella occidentalis

2.3 FoRDL, FoLCCH3和FoGRD氨基酸序列比对与结构分析

通过比较Ivf03和NIL-R品系FoRDL, FoLCCH3和FoGRD的氨基酸序列，未发现序列差异。西花蓟马与其他昆虫的GABAR亚基RDL, LCCH3和GRD氨基酸序列比对分析结果表明，3个GABAAR亚基均属于半胱氨酸环配体门控离子通道超家族，3个亚基之间具有典型的共同特征，每个亚基均具有6个N端胞外区环结构(loop A-F)，以及4个跨膜区(TM 1-4)，在不同昆虫间结构相似度高，且这些环结构、跨膜区的氨基酸序列具有很高的保守性(图4-6)。此外，RDL在loop D结构的上游存在可变剪切位点(图4)，对Ivf03和NIL-R品系的FoRDL测序结果进行多序列比对发现，在两个品系中均存在3种形式剪切体，结合实验室基因组数据表明，此3种形式是由于FoRDL外显子3的互斥剪切所致。

图4 西花蓟马FoRDL与其他昆虫的RDL亚基的氨基酸序列比对Fig. 4 Amino acid sequence alignment of FoRDL of Frankliniella occidentalis and RDL subunits from other insectsRDL亚基来源物种和GenBank登录号Origin species and GenBank accession numbers of RDL subunits: DmRDL: 黑腹果蝇Drosophila melanogaster, NP_729461; TcRDL: 赤拟谷盗Tribolium castaneum, NP_001107808; AmRDL: 意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica, XP_006565167.1. ☆表示相同的氨基酸残基Showing the identical amino acid residues; ■表示相似的氨基酸残基Showing the similar amino acid residues.

图5 西花蓟马FoLCCH3与其他昆虫的LCCH3亚基的氨基酸序列比对Fig. 5 Amino acid sequence alignment of FoLCCH3 of Frankliniella occidentalis and LCCH3 subunits from other insectsLCCH3亚基来源物种和GenBank登录号Origin species and GenBank accession numbers of LCCH3 subunits: DmLCCH3: 黑腹果蝇Drosophila melanogaster, NP_996469.1; TcLCCH3: 赤拟谷盗Tribolium castaneum, NP_001103251.1; AmLCCH3: 意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica, XP_026298398.1. ☆表示相同的氨基酸残基Showing the identical amino acid residues; ■表示相似的氨基酸残基Showing the similar amino acid residues.

图6 西花蓟马FoGRD与其他昆虫的GRD亚基的氨基酸序列比对Fig. 6 Amino acid sequence alignment of FoGRD of Frankliniella occidentalis and GRD subunits from other insectsGRD亚基来源物种和GenBank登录号Origin species and GenBank accession numbers of GRD subunits: DmGRD: 黑腹果蝇Drosophila melanogaster, NP_524131.1; TcGRD: 赤拟谷盗Tribolium castaneum, NP_001107772.1; AmGRD: 意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica, NP_001292813.1. ☆表示相同的氨基酸残基Showing the identical amino acid residues; ■表示相似的氨基酸残基Showing the similar amino acid residues.

2.4 FoRDL, FoLCCH3和FoGRD在不同龄期的表达模式

FoRDL,FoLCCH3和FoGRD在西花蓟马敏感品系的1-2龄若虫、蛹和成虫中均有表达，且均在成虫中表达量最高。其中FoRDL的表达量随着西花蓟马的发育而显著升高(P<0.05)(图7: A)；FoLCCH3在1-2龄若虫和蛹中表达水平相近，都显著低于成虫(P<0.05)(图7: B)；FoGRD在成虫和蛹中表达水平较高且二者水平相近，在1-2龄若虫中表达水平相近且均显著低于蛹或成虫(P<0.05)(图7: C)。FoRDL在抗性品系中表达量显著低于敏感品系(P<0.05)(图7: D)，而FoLCCH3和FoGRD的表达量在两品系间无显著差异(P>0.05)(图7: E, F)。

图7 FoRDL, FoLCCH3和FoGRD在西花蓟马多杀霉素敏感品系Ivf03不同发育阶段(A, B和C)及敏感品系Ivf03和抗性品系(NIL-R)成虫期(D, E和F)的相对表达量Fig. 7 Relative expression levels of FoRDL, FoLCCH3 and FoGRD in the spinosad susceptible strain ofFrankliniella occidentalis (Ivf03) at different developmental stages (A, B and C) and in the Ivf03 strainand the spinosad resistant strain (NIL-R strain) at the adult stage (D, E and F)Ivf03: 西花蓟马多杀霉素敏感品系Spinosad susceptible strain of F. occidentalis; NIL-R: 西花蓟马多杀霉素抗性近等基因系品系Near-isogenic line of the spinosad resistant strain of F. occidentalis; N1: 1龄若虫1st instar nymph; N2: 2龄若虫2nd instar nymph; P: 蛹Pupa; A: 成虫Adult. 图中柱表示平均值±标准误；柱上不同字母表示不同发育阶段基因表达量显著性差异(P<0.05, LSD)，柱上星号表示品系间差异显著(P<0.05, 独立样本t检验)。Data in the figures are mean±SE. Different letters above bars indicate significant difference in the gene expression level (P<0.05, LSD) among different developmental stages, and asterisk above bars indicates significant difference (P<0.05, independent samples t-test) between the strains.

2.5 FoRDL的RNAi及干扰后对多杀霉素的敏感性

西花蓟马敏感品系3日龄成虫饲喂dsFoRDL12和24 h后，FoRDL的表达量分别下调34.11%和45.16%，与对照组dsEGFP比较差异显著(P<0.05)，在饲喂36, 48和72 h后，FoRDL的表达量无显著种群差异(P>0.05)(图8: A)。干扰24 h后，西花蓟马对多杀霉素的敏感性显著降低，在0.250和0.400 mg/L处理浓度下，其死亡率分别从对照组的38.80%和50.12%显著降低到17.15%和28.57%(P<0.05)，即分别比对照下降了55.80%和43.00%(图8: B)。

图8 西花蓟马3日龄成虫中FoRDL RNAi后FoRDL的相对表达量(A)和FoRDL RNAi后再进行多杀霉素处理后的成虫死亡率(B)Fig. 8 Relative expression levels of FoRDL after RNAi of FoRDL in the 3-day-old adults of Frankliniella occidentalis (A)and the mortality rate of adults after treatment with spinosad following RNAi of FoRDL (B)dsEGFP: 对照组Control group; dsFoRDL: 处理组Treatment group. 图中柱表示平均值±标准误；柱上星号表示差异显著(P<0.05, 独立样本t检验)。Data in the figures are mean±SE. Asterisk above bars indicates significant difference (P<0.05, independent samples t-test).

3 讨论

本研究通过检索西花蓟马基因组GABAR家族基因，鉴定到5个GABAAR亚基基因和3个GABABR基因；西花蓟马FoRDL,FoLCCH3和FoGRD编码的氨基酸序列具有昆虫GABAAR亚基的典型结构；FoRDL外显子3存在着3种互斥剪切，它们可以形成3种不同的剪接体。RDL亚基的选择性剪切存在于多种昆虫中，黑腹果蝇体内的RDL亚基，外显子3和外显子6可通过选择性剪接编码形成4个不同的多态片段(Ffrench-Constant and Rocheleau, 1993)。在家蚕、意大利蜜蜂、赤拟谷盗和丽蝇蛹集金小蜂等昆虫中都存在RDL亚基外显子3和外显子6的不同的剪接形式(Jones and Sattelle, 2008; Jonesetal., 2010; Yuetal., 2010)。mRNA选择性剪切丰富了生物进化的方式，是形成蛋白质结构和功能多样性的重要机制，然而对昆虫RDL亚基不同剪接体的功能有待进一步研究。

昆虫的GABAAR作为杀虫剂的重要作用靶标，与乙酰胆碱酯酶、钠离子通道类似，一直是毒理学研究的热点。昆虫的GABAR主要存在于中枢神经系统和神经肌肉连接处(Bloomquist, 2001)，介导神经和肌肉细胞中快速的抑制性突触传递。西花蓟马GABAAR亚基基因FoRDL,FoLCCH3和FoGRD在敏感品系的各个发育阶段均有表达。虽然3个基因的表达模式有所不同，但是随着龄期的增长，表达量均呈现升高的趋势(图7)。Wei等(2015)研究发现，灰飞虱Laodelphaxstriatellus的RDL,GRD和LCCH3在其整个发育阶段均有存在且随着龄期的增长，相对表达量有着先降低后升高的趋势，表明GABAAR亚基基因在不同昆虫中表达模式有所不同。此外，GABAAR亚基基因在昆虫不同组织部位表达量也存在较大差异。小菜蛾和甜菜夜蛾两种昆虫头部的GABAAR亚基基因相对表达量显著高于胸部和腹部(周小毛等, 2006; Shangetal., 2009)，灰飞虱头部GABAAR亚基基因的表达量也显著高于胸部、腹部和足部(Weietal., 2015)。这可能与昆虫GABAAR主要存在于昆虫中枢神经系统有关。

对于昆虫GABAR在抗药性形成中的作用研究表明，黑腹果蝇对狄氏剂产生抗性与GABAR的RDL亚基A2′S和A2′G突变有关(Leeetal., 1993)。且在抗狄氏剂等环戊二烯类杀虫剂的德国小蠊Blattellagermanica、赤拟谷盗、小菜蛾等昆虫的RDL亚基中均发现了类似黑腹果蝇的A2′S和A2′G突变(Miyazakietal., 1995; Yuanetal., 2010; Gondhalekar and Scharf, 2012)。灰飞虱对氟虫腈产生抗性与GABAAR RDL高频率的A2′N突变有关(Nakaoetal., 2011)。Wei等(2015)对灰飞虱氟虫腈敏感品系和抗性品系的GABAAR的RDL亚基进行基因沉默后，使其对氟虫腈的敏感性分别降低了30%和27%，验证了RDL亚基作为氟虫腈靶标受体的功能。本研究比较了西花蓟马多杀霉素敏感和抗性品系的GABAAR亚基(FoRDL, FoLCCH3和FoGRD)氨基酸序列，未发现这些亚基在敏感和抗性品系中存在序列差异，但FoRDL的表达量在抗性品系中显著低于敏感品系(图7)。同时研究结果发现，干扰西花蓟马敏感品系FoRDL后进行生物测定，其成虫死亡率显著降低(图8)，由此推测西花蓟马GABAAR 的RDL 亚基可能与多杀霉素抗性有关。

目前昆虫对多杀霉素的抗性机制主要包括细胞色素P450s、多功能氧化酶(MFO)介导的代谢增强(Wangetal., 2006; Reyesetal., 2012; Rehan and Freed, 2014)和nAChR α6亚基的变异(Puineanetal., 2013; Silvaetal., 2016; Wanetal., 2018)。GABAR是多杀霉素的作用靶标之一，本研究表明西花蓟马GABAAR的RDL亚基基因可能参与了其对多杀霉素的抗性形成。这为我们深入了解西花蓟马对多杀霉素的抗性机制，及为西花蓟马的抗性治理和科学防控提供了理论依据。