2型糖尿病db/db小鼠血管内皮细胞原代培养和生长曲线检测*

陈雄林 杨耀防 熊含春

(1九江学院基础医学院医学遗传学与组织胚胎学教研室；2九江学院 江西九江 332000；3南昌大学第一附属医院麻醉科 江西南昌 330006)

糖尿病足(diabetic foot ulcer， DFU)是糖尿病的严重并发症之一，近年来已经成为发达国家非创伤性截肢的首要原因[1]。DFU与外周微血管病变和慢性炎症等因素相关，常导致足部感染和溃疡。DFU溃疡创面主要病理特征为胶原合成不良，慢性炎症反应，生长因子合成减少，血管再生、肉芽组织形成及上皮再生困难等[2]。糖尿病患者体内微血管病变是糖尿病并发症的主要原因。引起糖尿病微血管病变的因素较多，但血管内高血糖对血管内皮细胞损伤是主要因素。

血管内皮细胞是一种多功能细胞， 它是血管与外周组织进行物质交换的屏障，在血管生成、炎症反应与免疫应答方面发挥重要功能。血管内皮细胞通过发挥其生理功能参与体内多种疾病的病理生理过程， 并已成为动脉粥样硬化等心脑血管疾病、血管瘤、炎症、器官移植等相关疾病的治疗靶点[3]。因此，短期高效获得血管内皮细胞，为研究相关疾病奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料、试剂及仪器

2型糖尿病db/db小鼠由南京大学模式动物研究所提供。CCK-8购自加拿大Biotium公司。胎牛血清，青霉素-链霉素双抗，DMEM培养基，胰酶购自Invitrogen公司。96孔培养板和6孔培养板购自Corning公司。CO2培养箱购自Fouma Scientific Inc USA。酶标仪购自Labsystems Finland。

1.2血管内皮细胞原代培养

将2型糖尿病db/db小鼠颈椎脱臼 处死，置入75%的乙醇中浸泡消毒 5min，然后将小鼠置于无菌操作台并固定四肢。将小鼠胸腹腔逐层切开并暴露胸主动脉和腹主动脉，在脊柱左侧找到主动脉后解剖分离主动脉。分离胸、腹主动脉后立即放入含PBS的平衡液中，用注射器反复冲洗去除血管内的血细胞。将冲洗干净的动脉置于含DMEM培养液的培养皿中，纵行切开动脉后将血管剪成大小约 1mm×1mm的组织块，并将血管面朝下置于6孔板上放入 CO2培养箱中培养。 组织块培养60h后观察细胞生长情况，并将组织块去除并进行换液，以后每 2天换液 1次。

1.3 血管内皮细胞传代培养

当细胞融合成单层分布时按1∶2传代培养。用PBS液洗涤，然后加入0.25%胰蛋白酶，用移液器反复吹打充分消化，通过倒置显微镜观察细胞变圆形时，用含10%FBS的DMED培养基终止消化。离心后除去培养液，用D-hanks液冲洗1～2次。当细胞生长融合达到70～80%时，进行传代。重复上述传代过程2～3次，获得细胞均为血管内皮细胞。

1.4血管内皮细胞形态观察和生长曲线检测

1.4.1形态学鉴定 通过倒置相差显微镜观察原代血管内皮细胞和传代血管细胞。

1.4.2生长曲线测定 使用第4代血管内皮细胞进行生长曲线检测，将含10%FBS的DMED培养基使细胞数量重悬至2.5×104/mL，每孔加入细胞悬液100μL，每组设3个复孔，置于CO2培养箱中培养，隔天换液。用CCK-8检测细胞增值，每孔加入10Ul CCK-8溶液，通过酶标仪在450nm波长下检测每孔的OD值，重复测量3次。按上述步骤操作，连续检测8天的OD值，绘制细胞生长曲线。

1.5统计方法

通过SPSS20.0软件对OD值数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差 (s) 表示。

2结果

2.1原代与传代细胞

血管组织块贴壁培养60h后，通过倒置显微镜可见许多细胞从组织块边缘爬出，细胞呈扁平状，核椭圆形， 如图1A所示。将组织块移除后并换液，继续培养4～5d血管内皮细胞开始大量增值，当细胞生长融合至70%～80%时按1：2比例传代，继续培养。细胞传代后生长状态较好，细胞呈鹅卵石样，如图1B所示。

图1 血管内皮细胞原代培养与传代培养

(A) 血管内皮细胞原代培养，组织块贴壁培养60h后，血管内皮细胞从组织块边缘爬出；(B) 第3代血管内皮细胞。标尺为100μm(放大倍数×100)

2.2生长曲线

细胞培养第1、2、3、4、5、6、7、8d后，通过酶标仪检测其OD值，绘制生长曲线如图2所示。细胞生长规律为：接种第1d和第2d细胞数均较少，第3d细胞开始增生明显，第3～5d细胞表现为对数生长；第5d后细胞增殖速度下降。细胞整个生长曲线近似横置“S”形改变，表现为“潜伏期-对数生长期-平台期”的生长方式。

图2 血管内皮细胞生长曲线

4讨论

糖尿病足的创面由于伴随慢性炎症和血管增生减少，因此，糖尿病足临床治疗比较困难。对于糖尿病足慢性创面的清创处理，要建立在局部血液循环改善的基础上进行，因此，增加局部血液循环尤其重要。目前糖尿病足治疗方法较多，包括局部介入治疗、扩血管药物的使用、高压氧治疗以及干细胞移植和基因治疗等[3]。如果能全面了解创面血管内皮细胞的生理特点，为临床治疗和机制研究提供良好的条件。因此,体外建立血管内皮细胞培养体系尤为重要。

血管内皮细胞体外培养是研究血管生成及其相关疾病发病机制的重要手段，体外快速高效获得血管内皮细胞是研究的基础[4]。该实验结果表明，采用组织块法可以在体外成功获得血管内皮细胞，这是体外构建血管模型的细胞来源之一。在实验过程中，通过差异贴壁筛选血管内皮细胞，并对其生长过程进行检测，为研究其生物学特性和药物作用机制提供了良好的细胞模型。