竹叶提取物活性成分分析及其对酵母菌生长的影响

余 英 杨洁钰 易桂林 王 茜 余学军

(1 宜宾林竹产业研究院 四川宜宾 644000；2 浙江农林大学 杭州 311300)

糠壳是白酒酿造过程中最常用的辅料之一，其主要作用是为白酒酿造过程中的微生物生长繁殖提供优良的附着条件与微氧环境，但糠壳本身含有大量糠嗅味、泥腥味等邪杂气味，若控制不好糠壳清蒸工艺，容易给酒体带来异味[1]。竹叶中含有竹纤维，竹纤维的组织结构具有一定的硬度和吸水性，可为固态白酒发酵过程中的微生物繁殖代谢提供一定的空间支撑，且竹材料成本相比糠壳更低廉。目前已有研究表明，可以将竹材料应用到白酒固态酿造中，有效避免糠壳使用对酒体的影响，相比传统白酒其主体酯含量升高，糠醛等不利于口感的物质含量降低，酒体风味成分变丰富[2－3]。竹叶的提取物中含有竹叶黄酮、多糖、氨基酸及其衍生物等与人体生命活动有关的化合物，多种成分复合的竹叶提取物有着显著的抗氧化性能、防腐性能，具有降血脂、抗衰老、抗癌等作用，在食品、医疗、化妆品领域有重要的潜在应用价值[4－5]。但也有研究表明，竹叶中的活性成分有一定的抑菌作用，不同竹叶活性成分提取物对酵母菌生长影响也可能不同[6]。因此，本研究旨在探究宜宾市当地10 种代表性竹种的竹叶提取物的活性成分含量及其差异，并探究不同竹叶提取物对酵母菌生长的影响，以期为多种竹叶活性成分的合理开发利用提供一定的理论基础和科学依据，并筛选出适宜替代糠壳进行白酒酿造的竹种，以期为竹叶资源的开发利用开辟新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验选用的竹叶源自佯黄竹 (Bambusa changningensisYi et B.X.Li)、绵竹 (Bambusa intermediaHsueh et Yi)、硬头黄竹 (Bambusa rigidaKeng et Keng f.)、慈竹(Neosinocalamus affinis)、麻竹 (Dendrocalamus latiflorusMunro)、绿竹[Dendrocalamopsis oldhami(Munro) Keng]、楠竹[Phyllostachys heterocycla(Carr.) Mitford cv.Pubescens]、方竹[Chimonobambusa quadrangularis(Fenzi) Makino]、苦竹 [Pleioblastus amarus(Keng) keng]、箬竹 [Indocalamus tessellatus(Munro) Keng f.]等10 种宜宾代表性竹种，分别采摘自宜宾市翠屏区、南溪区、江安县、长宁县、兴文县等区(县)。

酵母菌:安琪酵母菌股份有限公司；葡萄糖标准品，芦丁标准品，没食子酸标准品，福林酚试剂(北京索莱宝试剂限公司)；氯化钠，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠，乙醇，柠檬酸钠，碳酸氢钠，锌粉，苯酚，浓硫酸，碳酸钠，酒石酸钾钠，硫酸铜，硫酸钠，碘化钾，碘酸钾，盐酸，亚铁氰化钾，硫酸锌，草酸，硫酸，硫代硫酸钠，淀粉，酚酞，醋酸钾，均为分析纯。

1.2 实验仪器

高压蒸汽灭菌锅:DSX-18L-I，上海申安医疗器械厂；循环水式真空泵:SHZ-Ⅲ，旋转蒸发仪:RE-2000A，上海亚荣生化仪器厂；鼓风干燥箱:DHG-9070A，真空干燥箱:DZF-6050，苏州江东精密仪器有限公司；超声波清洗机:F-060P，深圳福洋科技集团有限公司；振荡器:HY-3A，常州迈科诺仪器有限公司；紫外可见分光光度计:UV-1750，日本岛津公司；电热恒温水浴锅，北京中兴伟业仪器有限公司；粉碎机:S4-M71，九阳股份有限公司；集热式磁力搅拌器:DF-101S，巩义市予华仪器有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1 竹叶提取物的制备

将新鲜采集的竹叶用清水冲洗，沥干，置于鼓风干燥箱中分摊，50 ℃干燥至恒重，用粉碎机将其粉碎得竹叶干粉，精密称取竹叶粉末15 g 于250 mL 锥形瓶中，加入150 mL 60%乙醇，超声30 min，抽滤得竹叶提取物溶液，用旋转蒸发仪浓缩，50 ℃真空干燥得到竹叶60%乙醇提取物，冷藏备用[7]。

1.3.2 竹叶提取物成分测定方法

1) 总黄酮含量测定。采用比色法测定竹叶提取物中总黄酮含量，具体方法参考国标SN/T4592—2016。

2) 总多酚含量测定。福林－酚比色法测定竹叶提取物中总多酚含量，具体方法参考李巨秀等[8]的方法，具体操作为:0.05 g 竹叶提取物60%乙醇定容至50 mL，得到样品液，取0.5 mL样品液，1.0 mL Folin-Ciocalteu 试剂及2.0 mL 质量分数为12%的Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至25 mL，20 ℃避光反应2 h 后，以试剂空白为对照，在波长760 nm 处测定其吸光度值A，以吸光度为纵坐标，没食子酸溶液质量浓度为横坐标绘制标准曲线，根据标准曲线计算其多酚含量。

3) 总糖含量测定。测定方法参考国标SN/T4260—2015。

4) 还原糖含量测定。测定方法参考国标NY/T1278—2007。

5) 多糖含量测定。竹叶提取物中的总糖含量减去还原糖含量，即为竹叶多糖的含量[9]。

1.3.3 竹叶提取物对酵母菌生长的影响

竹叶提取物抑菌活性的测定采用滤纸片法，又称抑菌圈法或琼脂平板法。滤纸片法实验步骤如下:

1) 滤纸片的制备:用打孔器将滤纸制成直径为6 mm 的圆片，放入干燥洁净的试管中经121 ℃湿热灭菌20 min，浸入各浓度竹叶提取液中，1 h后取出。

2) 菌悬液的制备:取一定量安琪酵母菌于30℃无菌生理盐水中，恒温培养箱30 ℃活化1 h，制得酵母菌菌原液。吸取1 mL 菌原液加入9 mL无菌生理盐水中，得到稀释10 倍的菌悬液，依次进行梯度稀释。将不同稀释度的菌悬液各吸取150 μL 分别加入到已灭菌冷却的酵母菌浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基上，涂布均匀，28 ℃培养48 h观察，酵母菌能长满整个培养皿且分布均匀为适宜的菌液浓度。

3) 无菌移液管移取菌悬液150 μL 加在已倒好的平板培养基表面，涂布均匀，用无菌镊子夹取已制备好的滤纸片，放到含菌平皿上，每皿4片，培养皿28 ℃培养48 h 后，观察量取抑菌圈直径，抑菌圈直径越大表明抑菌活性越强[10]。

酵母菌浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基配方:1%酵母菌膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂粉。

1.4 数据处理

各实验重复2 次，各样品的指标平行测定3次，结果以平均值±标准偏差表示。使用SPSS 22.0 软件对数据进行单因素方差分析 (当P<0.05 时判断组间存在显著差异)，用Origin 2016 64Bit 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 竹叶提取物黄酮含量分析

从图1 可见，在不同竹种竹叶中黄酮含量不同，竹叶60%乙醇提取物中黄酮含量从高到低排序依次为佯黄竹>方竹>苦竹>绵竹>绿竹>楠竹>箬竹>慈竹>麻竹>硬头黄竹；黄酮含量最高的为佯黄竹、达到12.86%，含量最低的是硬头黄竹、仅有3.24%，其余竹种竹叶黄酮含量在4.14%～9.88%；不同竹种间竹叶提取物中黄酮含量差异显著(P<0.05)。竹种竹叶活性成分含量与遗传、气候、环境等因素有关，佯黄竹、方竹、苦竹竹叶中黄酮含量丰富，可作为黄酮提取的重要潜在植物来源。

图1 不同竹种竹叶提取物总黄酮含量Fig.1 The flavonoids content of bamboo leaf extracts from different bamboo species

2.2 竹叶提取物多酚含量分析

从图2 可见，在竹叶60%乙醇提取物中多酚含量从高到低排序依次为慈竹>佯黄竹>方竹>楠竹>绿竹>苦竹>硬头黄竹>绵竹>箬竹>麻竹；含量最高的为慈竹、达到10.32%，含量最低的是麻竹、仅有4.54%；在部分竹种间竹叶提取物中多酚含量差异显著(P<0.05)，部分竹种间多酚含量差异不显著(P>0.05)，如佯黄竹和方竹多酚含量均在8.22%左右，楠竹、苦竹、绿竹多酚含量在7.40%左右。

图2 不同竹种竹叶提取物总多酚含量Fig.2 The polyphenol content of bamboo leaf extracts from different bamboo specie

与图1 比较可以发现，在竹叶提取物中黄酮含量与多酚含量没有明显关系，黄酮和多酚含量丰富的竹种为佯黄竹、方竹、苦竹、慈竹，在其竹叶提取物中黄酮和多酚总含量均在15%以上，说明这几种竹叶可作为黄酮、多酚的重要潜在植物来源。但黄酮和多酚均具有一定抑菌性，其含量高的竹叶作为白酒酿造辅料时可能抑制酵母菌生长，且在不同地域或季节的竹叶中活性成分含量可能不同，其对酵母菌的抑制作用也不同。

2.3 竹叶提取物总糖含量分析

从图3 可见，在不同竹种竹叶60%乙醇提取物中总糖含量均不高，含量为0.61%～1.16%，从高到低排序依次为楠竹>慈竹>绿竹>麻竹>硬头黄竹>绵竹>箬竹>方竹>佯黄竹>苦竹；提取物中总糖含量最高的为楠竹和慈竹，分别为1.16%和1.13%，且二者间含量差异不显著(P>0.05)；含量最低的为苦竹、佯黄竹，分别为0.61%、0.63%，二者间含量差异亦不显著(P>0.05)。测定结果比陆志科等[11]测定的竹叶总糖含量偏低，这是因为提取方法的差别，且在本研究中由60%乙醇提取得到的糖不含不溶性糖，总糖含量低，说明用60%乙醇提取得到的竹叶中的活性物质主要是黄酮和多酚。

图3 不同竹种竹叶提取物总糖含量Fig.3 The sugar content of bamboo leaf extracts from different bamboo species

2.4 竹叶提取物还原糖含量分析

还原糖是指具有还原性的糖类，分子中含有游离醛基或酮基的单糖和含有游离醛基的二糖都具有还原性，还原性糖主要有葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖等。从图4 可看出，在不同竹种竹叶60%乙醇提取物中还原糖含量均不高，含量为0.09%～0.29%，从高到低排序依次为慈竹>方竹>箬竹>硬头黄竹>麻竹>苦竹>绿竹>绵竹>佯黄竹>楠竹；还原糖含量最高的是慈竹，最低的是楠竹。

图4 不同竹种竹叶提取物还原糖含量Fig.4 The reducing sugar content of bamboo leaf extracts from different bamboo species

2.5 竹叶提取物多糖含量分析

将样品溶液中的总糖含量减去还原糖含量，即为竹叶多糖的含量[9]。图5 为不同竹种竹叶提取物多糖含量，在不同竹种竹叶60%乙醇提取物中多糖含量为0.46%～1.07%，从高到低排序依次为楠竹>慈竹>绿竹>麻竹>绵竹>硬头黄竹>佯黄竹>苦竹>箬竹>方竹；多糖含量最高的是楠竹，最低的是方竹；在部分不同竹种间竹叶提取物中多糖含量差异显著(P<0.05)。结合图3 和图4可发现，不同竹种竹叶内总糖、还原糖、多糖含量无明显关系。有文献报道竹叶多糖对人体有独特的保健功效，丁红秀[12]研究发现竹叶多糖综合表现为广谱抗菌活性，但对真菌无抑制作用，说明竹叶多糖可能对酵母菌生长无抑制作用。

图5 不同竹种竹叶提取物多糖含量Fig.5 The polysaccharide content of bamboo leaf extracts from different bamboo species

2.6 竹叶提取物对酵母菌生长的影响

图6 是不同竹种竹叶提取物浓度为16 mg/mL时对酵母菌抑制生长的情况，分析发现，当竹叶提取物在一定浓度范围时，不同竹种竹叶提取物对酵母菌的抑菌圈直径仅为6.15～9.20 mm，说明在浓度较高时，不同竹种竹叶提取物的抑菌作用均不明显，其中除佯黄竹和方竹外，其余竹叶的抑菌圈大小均<7 mm，可认为对酵母菌无抑菌作用[13]，在方菊等[14]、许钢等[15]的研究中也发现高浓度的竹叶提取物对酵母菌生长无明显抑制作用。在本研究中，佯黄竹对酵母菌的抑菌圈直径最大为9.20 mm，说明佯黄竹竹叶提取物对酵母菌的抑菌作用强于其他竹种，根据图1—图5对竹叶提取物各成分含量分析，黄酮和多酚物质可能在竹叶提取物抑菌性中占主导作用。在本研究中，部分结果与陆志科等[11]研究结果不同，这可能是因竹叶中抗菌成分的含量受种类、遗传因素、环境条件等多种因素影响所致。

图6 不同竹种竹叶提取物对酵母菌生长的影响Fig.6 Effects of bamboo leaf extracts from different bamboo species on yeast growth

在白酒酿造过程中，辅料对酿酒微生物生长繁殖的影响主要在于辅料中各种物质成分对微生物生长的促进或抑制作用，原理是物质环境对微生物体内酶的活性的影响[16]。除佯黄竹外，其余竹种竹叶中的主要活性成分对白酒酿造过程中的主要微生物酵母菌的抑制作用极小，说明竹叶作为白酒酿造辅料具有可行性。

3 结论

在宜宾10 种不同竹种竹叶提取物中黄酮、多酚、总糖、还原糖、多糖含量受竹种类、遗传、环境等因素影响，不同竹种60%乙醇提取物中的活性成分含量不同，其主要活性成分是黄酮和多酚，总糖、还原糖、多糖含量较少。其中，黄酮含量为3.24%～12.86%，黄酮含量最高的为佯黄竹，含量最低的是硬头黄竹，且不同竹种间黄酮含量差异显著(P<0.05)；多酚含量为4.54%～10.32%，多酚含量最高的是慈竹，最低的是麻竹，部分不同竹种间竹叶多酚含量差异显著(P<0.05)；在不同竹种竹叶提取物中总糖、还原糖、多糖含量均不高，总糖含量为在0.61%～1.16%，还原糖含量为0.09%～ 0.29%，多糖含量为0.46%～1.07%。黄酮和多酚含量最丰富的竹种为佯黄竹、方竹、苦竹、慈竹，竹叶提取物中黄酮和多酚总含量均在15%以上，可作为黄酮、多酚的重要潜在植物来源。

在不同竹种竹叶提取物对酵母菌生长的影响实验中发现，在高浓度下，除佯黄竹竹叶提取物对酵母菌出现明显抑菌圈外，其余竹种均无明显抑菌圈，表明在一定浓度下，竹叶中的主要活性成分对白酒酿造过程中的主要微生物酵母菌的生长无影响，竹叶作为白酒酿造辅料具有可行性，可结合地域资源和各活性成分含量情况选择适宜的竹种作为酿酒辅料，以资源丰富、活性成分含量高、对酵母菌生长无抑制作用的竹种为佳。利用竹叶替代糠壳作为辅料生产白酒，可提升宜宾竹资源利用率，丰富宜宾竹文化、酒文化，并带来直接的经济效益，对推动宜宾竹产业高质量发展将有重要意义。