小麦秸杆好氧堆肥过程中微生物多样性与优势菌群分析

张 秧，艾为党，冯海艳，靳向丹，陈艳武，张良长

（1.中国航天员科研训练中心，北京 100094；2.中国地质大学（北京）地球科学与资源学院，北京 100083；3.深圳市绿航星际太空科技研究院，深圳 518117）

0 引 言

受控生态生保系统（Controlled Ecological Life Support System，CELSS）是在有限密闭空间内构建的“人-植物-微生物-环境”自循环式闭路生态系统，被认为是未来长期地外生存等载人航天任务必备的生保系统形式。其中，植物可为航天员提供新鲜食物并制造氧气，是关键生物部件，如小麦被认为是系统的主要粮食提供者[1-2]。然而，这些植物提供食物的同时，也会产生一定量的固体废物（如小麦秸秆等），这部分固废必须进行资源化处理回用[3-4]。

好氧堆肥技术具有反应条件温和、耗能低等特点，被认为是未来受控生态生保系统固废资源化处理的优选技术之一[5]。该技术是通过多种微生物的协同作用来完成生物质物料的降解，但不同堆肥发酵阶段中微生物的群落结构不同。Langarica等[6]研究了厨余垃圾和园林废弃物堆肥中真菌的群落特征。其中，子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）和毛霉亚门（Mucoromycotina）的相关菌群在堆肥过程中占据了优势地位。Meng等[7]研究了猪粪稻壳堆肥过程中细菌和真菌的群落组成，发现在堆肥初期，莫拉氏菌科（Moraxellaceae）、黄杆菌科（Flavobacteriaceae）、双足囊菌科（Dipodascaceae）和酵母菌科（Saccharomycetaceae）为优势菌群；到了堆肥末期，厌氧绳菌科（Anaerolineaceae）、毛壳菌科（Chaetomiaceae）和梭菌科（Clostridiaceae）占据优势地位。Li等[8]对松叶猪粪堆肥过程中的真菌群落结构进行分析，发现异担子菌属（Heterobasidion）、毛霉属（Mucor）和篮状菌属（Talaromyces）等菌群的相对丰度较高，并且其丰度变化和堆肥的温度、pH值、CO2和CH4排放及种子萌发指数（GI）有关。张文浩等[9]分析了牛粪稻秸静态堆肥过程的真菌群落动态变化，发现升温期节担菌属和毛孢子属占优势，高温期时嗜热链球菌属成为优势菌群，鬼伞属和未分类的子囊菌门在腐熟期时相对丰度较大。邓辉等[10]研究了猪粪木屑堆肥过程中放线菌的多样性变化，发现堆肥初期以棒状杆菌为主，高温期演变为糖单孢菌属、乔治菌属和嗜热裂孢菌属，降温期时占据优势地位的菌群为糖单孢菌属、短杆菌属和杆菌属，充分说明微生物菌群在堆肥过程中起到了重要作用。然而，目前专门针对小麦秸秆好氧堆肥过程中的微生物多样性研究较少，对麦秸起到降解作用的功能菌群了解不深。因此，小麦作为未来受控生态生保系统中主要粮食作物，开展对小麦秸秆的好氧堆肥处理技术研究，分析其小麦秸秆堆肥过程中的微生物多样性变化和群落演替规律，对于明确降解小麦秸秆的功能菌群、阐明物料降解机理、提高堆肥效率至关重要。

本研究采用强制通风好氧堆肥装置对小麦秸秆进行好氧堆肥处理，通过接种不同商业菌剂获取更全面的功能菌群，对不同发酵阶段的微生物多样性及群落结构进行高通量测序分析，为筛选研制高效降解小麦秸秆的专用微生物菌剂提供参考。

1 试验方法

1.1 物料好氧堆肥方法

堆肥物料为小麦秸秆和厨余垃圾的混合物，其中小麦秸秆购自江苏某农场，厨余垃圾取自某单位食堂。混合后的物料C/N比控制在30:1，水分含量控制在65%左右。微生物菌剂选用 3种适用于秸秆腐熟的商业菌剂，分别为QD菌剂（主要为乳酸菌、木霉菌和芽孢杆菌等）、DH菌剂（主要为芽孢杆菌、米根霉、酵母菌和戊糖片球菌等）和VT菌剂（主要为酵母菌、乳酸菌和芽孢杆菌等），菌剂接种量按物料总质量的0.5%添加。

堆肥装置如图1所示，主要由带盖塑料桶（桶有效容积为19 L，桶外壁包裹有两层保温棉，桶顶部放置有温度计，桶底部设置有物料托盘）、温度控制系统和通气系统3部分组成。试验共设置3个处理组，分别为QD组、DH组和VT组，每组均设置3个重复试验，每个堆肥桶内均含物料3.50 kg，通风量设置为1.0 L/min，试验周期设定为30 d。

1.2 堆肥过程测试参数

堆肥过程主要对堆体温度、有机质含量、总碳、总氮等进行测试。温度采用温度计测定。将温度计插入物料中间及周围3点20 cm处测定温度，取4点温度的平均值作为最终结果，温度每隔24 h测定1次。有机质含量、总碳、总氮分别采用灼烧法和元素分析仪测定[11]。

1.3 微生物样品采集及多样性分析测试

根据堆肥过程的温度变化情况，选取堆肥过程 3个典型发酵阶段的物料样品，分别为第 2天（升温期，样品编号 QD1、DH1、VT1）、第 6天（高温期，样品编号QD2、DH2、VT2）和第20天（降温期，样品编号QD3、DH3、VT3），采用16s rDNA高通量测序方法对堆肥样品中的微生物多样性进行分析。

样品测序使用的通用引物是 338F（ 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGGAG-3′） 和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），对样品中细菌的16s rRNA的V3~V4区域进行扩增。另外，使用引物528F （ 5′-GCGGTAATTCCAGCTCCAA-3′） 和 706R（5′-AATCCRAGAATTTCACCTCT-3′）对样品中真菌的18s rRNA的V3~V4区域进行扩增。得到PCR扩增产物后，采用 Illumina MiSeq/NovaSeq平台对其进行双端测序。对测序结果进行过滤处理，得到优化序列，进行去嵌合体处理后将序列在 97%的相识水平上进行 OTU聚类，利用 R语言分析样品在不同分类水平上的群落组成及相对丰度。

2 结果与讨论

2.1 3种菌剂处理下堆体理化性质变化

3种菌剂处理下堆体的理化性质变化情况如表1所示。由表1可知，3种菌剂处理下的堆体最高温度分别达到58.2、54.7和53.7℃，高温持续时间分别达到9、6和6 d。堆温反映了堆体中微生物的活性，微生物的活性越高其产热量越大，表现为堆温峰值越高，持续时间越长。3种菌剂处理下堆体的温度峰值与高温持续时间有所不同，表明不同菌剂处理下堆体中的微生物活性有所差别。3种菌剂处理下堆体的有机质降解率有所不同，分别达到18.87%、24.48%和22.08%，表明不同菌剂处理下堆体中的微生物对物料的降解活性有所差异，但差异性不是很大。产物C/N比是判断堆体腐熟的一个重要指标，3种菌剂处理下堆体的C/N比均由初始的30:1降至12:1以下，达到堆体腐熟的标准[12]。堆体的理化性质变化情况表明，3种菌剂对小麦秸秆均有一定的降解作用，堆体可达到腐熟要求，而堆体的变化与其中的微生物活动密切相关。在不同的发酵阶段，由于温度的变化微生物群落发生交替演变，群落结构会发生明显变化。研究表明[13]，在好氧堆肥过程中堆肥前期主要以嗜温微生物为主，高温期则演变为嗜热微生物，后期温度下降嗜温微生物重新占据主要地位。

表1 不同处理下堆肥理化性质变化Table 1 Changes of physical and chemical properties of different treatments during composting

2.2 堆肥过程不同典型发酵阶段微生物多样性

2.2.1 Alpha多样性和Beta多样性

Alpha多样性用于衡量样品在局部均匀生境下的物种丰富度和多样性。通常以 Chao1指数表征丰富度，以Shannon和Simpson指数表征多样性[14]。9组样品的Alpha多样性分析结果如表2所示。

表2 堆肥过程典型发酵阶段的Alhpa多样性指数表Table 2 Alhpa diversity index of typical fermentation stages during composting

由表2可知，随着堆肥过程的进行3种菌剂处理下堆体中的物种丰富度和多样性均呈现出高-低-高的变化趋势，在堆肥初期 QD、DH、VT的 Chao1指数分别为600.61、578.83、1137.13，Simpson指数分别为 0.98、0.96、0.98，表明3组处理下堆体中的微生物种类和数量丰富。这是因为，接种菌剂后堆体中的微生物群落结构丰富且多样化，这有助于堆肥反应的启动。进入高温期后，3组处理下堆体中的物种丰富度和多样性急剧下降，Chao1指数和Simpson指数分别降至168.08、152.71、204.02和0.49、0.49、0.66，说明由于堆体温度的升高，堆体内微生物的群落结构发生剧烈变化，嗜温微生物活性受到严重影响，嗜热微生物逐渐取代嗜温微生物并占据优势地位，从而导致堆体内的物种丰富度和多样性降低。在降温期 3组处理的 Chao1指数和 Simpson指数分别为 565.81、330.69、490.11和0.96、0.94、0.95，说明随着温度下降堆体中嗜热微生物的活性下降，嗜温微生物的活性再次上升，堆体中的物种丰富度和多样性均有所回升。

Beta多样性是指在不同环境的不同群落之间，样品间物种组成的差异性，通过主成分分析（Principal Co-ordinates Analysis，PCA）可以对Beta多样性指数进行解释。3种菌剂处理下堆肥不同发酵阶段的细菌和真菌Beta多样性如图2a和图2b所示。由图2a可知，QD1、DH1和VT1聚为一组，QD2、DH2和VT2聚为一组，QD3、DH3和VT3聚为一组。由图2b可知，QD1、DH1和VT1之间的距离较近，而其余6个点位分布较分散，无明显聚集现象。Beta多样性分析结果表明，对于堆肥过程中的细菌，同一菌剂处理下不同发酵阶段的细菌组成存在显著差异，不同菌剂处理下同一发酵阶段的细菌组成结构类似，3种菌剂对小麦秸秆起到降解作用的细菌功能菌群有相似性，而在不同发酵阶段的细菌群落结构存在差异性。对于堆肥过程中的真菌，在堆肥初期 3种菌剂处理下的菌群结构相似。随着堆肥过程的进行群落结构发生明显变化，相互之间存在显著差异，表明同一菌剂处理下堆体中的真菌群落在堆肥过程中发生了较大的交替演变，而不同菌剂处理下堆体中的真菌群落组成有所不同。

2.2.2 OTU聚类分析

对堆肥各典型发酵阶段的微生物进行OTU聚类，可以反映不同处理在相同发酵阶段的物种数变化。细菌和真菌的OTU聚类结果如图3a和图3b所示。

由图3可知，整个堆肥过程中细菌共有的OTUs为7个，真菌共有的OTUs为6个，表明在堆肥过程中有部分细菌和真菌自始至终一直存活。在升温阶段细菌的OTU数达到375个，真菌的OTU数达到128个。进入高温阶段后细菌的OTU数增加至1 139个，而真菌的OTU数减少至76个。降温阶段时细菌的OTU数继续增大至1 665个，真菌的OTU数减少至44个。微生物的OTU数变化表明，堆肥系统中的细菌种类不断增多，且升温-高温期的增长速率大于高温-降温期的增长速率，这是因为在发酵初期堆肥系统内存在部分厨余垃圾，含有大量的糖类、蛋白质等易被细菌利用的物质，细菌的活性不断增强，逐渐适应环境并大量繁殖。堆肥系统中的真菌种类不断减少，且升温-高温期的减少速率大于高温-降温期的减少速率，这是因为在发酵初期部分真菌不适应发酵环境而逐渐被淘汰，进入高温期后真菌逐渐适应发酵环境并开始大量繁殖。

2.2.3 微生物群落结构变化

1）细菌群落结构变化与优势菌群

3种菌剂处理下不同典型发酵阶段在属水平上的细菌群落结构如图4所示。由图4可知，在升温期QD、DH和VT中共有的优势菌群为片球菌属（Pediococcus），相对丰度分别达到 73.07%、73.54%和59.43%。此外，QD和 DH处理中相对丰度较高的包括魏斯氏菌属（Weissella）和乳酸菌属（Lactobacillus）；VT处理中相对丰度较高的包括魏斯氏菌属、乳酸菌属和好氧芽孢杆菌属（Aeribacillus）。进入高温期后细菌的OTU数大幅度上升，3组处理下堆体的细菌种类显著提高。其中，QD处理下的优势菌群演变为假黄色单胞菌属（Pseudoxanthomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）和尿素芽孢杆菌属（Ureibacillus），相对丰度分别为27.03%、24.05%和 16.69%；DH处理下的优势菌群演变为芽孢杆菌属和尿素芽孢杆菌属，相对丰度分别达到 41.39%和20.57%；VT处理下的优势菌群演变为好氧芽孢杆菌属（Aeribacillus）和芽孢杆菌属，相对丰度分别为34.03%和24.17%。降温期时细菌的OTU数继续增大，3组菌群的相对丰度分布较为均匀。QD中相对丰度较高的主要为绿屈挠菌科（Chloroflexaceae）、固氮螺菌属（Azospirillum）和假黄色单胞菌属；DH中相对丰度较高的主要为螯台球菌属（Chelatococcus）和根瘤菌属（Chelativorans）；VT中相对丰度较高的主要为螯台球菌属和芽孢杆菌属。

结合 3组处理在不同典型发酵阶段的细菌群落变化情况，在升温期3组处理共同的优势菌群包括片球菌属、魏斯氏菌属和乳酸菌属。其中，片球菌属在玉米秸秆青贮发酵过程中对木质纤维素有一定的降解作用，能将木质纤维素转化为单糖[15]。魏斯氏菌属在各类发酵食品中起到了关键作用，可降解油脂与糖类物质[16]，乳酸菌属则常见于各种酸奶发酵工艺中。进入高温期后 3组处理共同的优势菌群包括假黄色单胞菌属、芽孢杆菌属和尿素芽孢杆菌属。其中，芽孢杆菌属是广泛存在于粪便堆肥中的微生物，可以降解有机物，具有一定的木质纤维素降解活性[17]。尿素芽孢杆菌属可以有效地降解纤维素、木质素等有机物[18]。相关研究表明[19]，假黄色单胞菌属对南方根结线虫的防治效果可达到52.1%，该现象可为减少堆体中的病虫害提供思路。在降温期时共同的优势菌群包括芽孢杆菌属、螯台球菌属和根瘤菌属。其中，螯台球菌属具有降解青霉素的功能[20]。根瘤菌属是一种好氧反硝化细菌，对于EDTA类物质有一定的降解作用[21]。

2）真菌群落结构变化与优势菌群

3种菌剂处理下不同典型发酵阶段在属水平上的真菌群落结构如图5所示。由图5可知，升温期时QD处理下的优势菌群主要分布在念球菌属（Candida）和节担菌属（Wallemia），相对丰度分别为83.18%和12.13%；DH处理下的优势菌群主要为曲霉属（Aspergillus）和节担菌属，相对丰度分别达到79.67%和8.84%；VT处理下的优势菌群为曲霉属，相对丰度为94.20%。进入高温期后QD处理下的优势菌群演变为曲霉属，相对丰度达到90.67%，并出现了新的菌群横梗霉属（Lichtheimia）；DH处理下的优势菌群演变为根毛霉属（Rhizomucor）和嗜热霉菌属（Thermomyces），相对丰度分别为59.31%和33.54%；VT处理下几乎都为嗜热霉菌属，相对丰度达到99.88%。在降温期 QD处理下的优势菌群演变为嗜热霉菌属和嗜热链球菌属（Mycothermus），相对丰度分别为 86.99%和12.72%；DH处理下嗜热毁丝霉菌属（Myceliophthora）和嗜热霉菌属占据优势地位，相对丰度分别达到84.84%和10.28%；VT处理下的优势菌群主要为嗜热霉菌属和嗜热毁丝霉菌属，相对丰度分别为67.69%和27.76%。

结合 3组处理在不同典型发酵阶段的真菌群落变化情况，在升温期 3组处理共同的优势菌群包括曲霉属、念球菌属和节担菌属。其中，曲霉属可以分泌纤维素酶，对纤维素有较强的降解能力[22-23]；念球菌属则对糖类和油脂有着一定的降解能力[24]。进入高温期后 3组处理共同的菌群逐渐演变为嗜热霉菌属、曲霉属和根毛霉属。其中，嗜热霉菌属和根毛霉属对纤维素和木聚糖有较强的降解活性[25-26]。在降温期时 3组处理中共同的优势菌群包括嗜热霉菌属和嗜热链球菌属。其中，嗜热链球菌属对半纤维素有一定的降解能力[27]。在升温期微生物种类主要以片球菌属（Pediococcus）、曲霉属（Aspergillus）和魏斯氏菌属（Weissella）为主，相对丰度分别占细菌和真菌的 68.68%、59.17%和 12.21%；嗜热霉菌属（Thermomyces）、芽孢杆菌属（Bacillus）和根毛霉属（Rhizomucor）在高温期占据优势地位，相对丰度分别占细菌和真菌的45.21%、29.87%和19.79%；降温期优势菌群演变为嗜热霉菌属、绿屈挠菌科（Chloroflexaceae）和嗜热链球菌属（Mycothermus），相对丰度分别占细菌和真菌的79.84%、16.92%和7.97%。

2.3 堆肥过程微生物菌群代谢功能通路

多样性分析虽然可以揭示微生物群落的演替规律，但无法准确说明菌群在堆肥过程中起到的作用及功能。通过代谢组学检测，将结果与代谢组数据库进行比对对微生物菌群的代谢功能通路进行分析，可以明确菌群的代谢功能，从而充分说明菌群在堆肥发酵过程中起到的作用。其中，KEGG数据库是日本京都大学和东京大学联合开发的数据库，可以查询微生物的代谢途径、酶、产物等[28]。MetaCyc数据库是通过试验数据阐明的生命科学领域内的代谢通路数据库，可以查询微生物的初级和次级代谢以及相关代谢物、反应、酶和基因[29]。

2.3.1 细菌菌群代谢功能通路

运用KEGG数据库对细菌菌群的代谢功能通路进行统计分析，结果如表3所示。

由表3可知，在整个堆肥过程中细菌菌群在代谢（Metabolism）上的通路统计最为丰富。其中，菌群主要对碳水化合物代谢、氨基酸代谢以及辅酶因子和维生素代谢有着较强的表达能力，说明细菌菌群在堆肥过程中对物料中有机物有着充分的利用。此外，细菌菌群对于萜类和多酮类化合物和聚糖等代谢产物也表现出较强的降解能力，前者在小麦储藏过程中含量较高[30]，后者则属于生物可降解部分，说明堆肥物料中的大分子物质如淀粉、纤维素等被微生物利用，降解形成了多糖等代谢产物。此外，针对人类疾病（Human Diseases）的代谢功能通路统计丰度几乎为0，这是因为在堆肥过程中由于堆温较高且高温的持续时间较长，对堆体中的致病性病原菌有较强的杀灭作用，导致堆肥过程堆体中的病原菌数量极少，可以很好地满足堆肥无害化的要求[12]。

2.3.2 真菌菌群代谢功能通路

运用MetaCyc数据库对真菌菌群的代谢功能通路进行统计分析，结果如表4所示。由表4可知，真菌菌群在前体代谢物和能量产生（Generation of Precursor Metabolite and Energy）代谢通路上，呼吸作用（Respiration）的丰度最大，说明在堆肥过程中堆体的通气性得到较好的维持，堆体内部氧气提供充足，为微生物提供了适宜生长的富氧环境。在生物合成（Biosynthesis）代谢通路上，辅酶因子、辅基、电子载体和维生素的代谢表达丰度最高，其次是脂肪酸、核苷酸、碳水化合物和氨基酸等，这些产物均为微生物在生命活动中产生的各种代谢物质。在聚糖通路（Glycan Pathways）上，有一定程度的聚糖生物合成，表明真菌菌群对堆体中木质纤维素的降解有一定的基因表达，分泌的纤维素酶可以有效降解木质纤维素并将其转化为聚糖等物质[31]。

表4 堆肥过程真菌菌群MetaCyc部分代谢功能通路特征Table 4 MetaCyc metabolic pathway characteristics of fungi during composting

3 结 论

本文通过接种 3种菌剂对小麦秸秆进行好氧堆肥处理，使用16s rDNA高通量测序技术对堆肥过程各典型发酵阶段中的微生物多样性进行了测试和分析，结论如下：

1）3种菌剂处理下的堆体性质发生明显变化，接种的菌剂种类不同导致堆体中微生物的群落结构不一致，对物料的降解效果不同，在温度峰值、高温持续时间和VS降解率等方面表现出差异性。

2）3种菌剂处理下堆体的微生物多样性变化显著，各典型发酵阶段之间优势菌群存在差异。在升温期主要以片球菌属、曲霉属和魏斯氏菌属为主，相对丰度分别占细菌和真菌的68.68%、59.17%和12.21%；嗜热霉菌属、芽孢杆菌属和根毛霉属在高温期占据优势地位，相对丰度分别占细菌和真菌的45.21%、29.87%和19.79%；降温期优势菌群演变为嗜热霉菌属、绿屈挠菌科和嗜热链球菌属，相对丰度分别占细菌和真菌的79.84%、16.92%和7.97%。

3）在小麦秸秆好氧堆肥过程中，微生物菌群的代谢功能通路丰富。其中，细菌菌群对糖类、油脂等物质有较强的降解作用，真菌菌群对木质纤维素等相关的代谢功能突出。

该研究明确了麦秸堆肥过程中的优势功能菌群，对这些优势功能菌群的理化性质开展研究，可进一步明确其降解功能特性，从而为研制高效降解小麦秸秆的微生物菌剂提供参考，为解决CELSS小麦秸秆等固体废物的资源化处理问题提供思路。