LC-MS/MS法测定大鼠血浆中EGCG及其药动学研究

乔妙 朱朋艳 赵云丽 黄艳苹 吴凡 高文分 盛军 袁文娟 王宣军

摘要 [目的]建立一种LC-MS/MS测定大鼠血浆中EGCG浓度的方法，进而研究其药动学。[方法]选用Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈-水（90∶10）为流动相，等度洗脱，ESI离子源，多反应离子监测，负离子扫描;以香草醛为内标，采用内标法定量。[结果]EGCG和内标不受基质干扰;定量限分别为10 ng/mL（EGCG）和5 ng/mL（香草醛），血浆样品批内和批间精密度（RSD）≤11.5%，准确度在92.0%～118.9%，萃取回收率≥92.7%，基質效应为95.3%～115.3%，大鼠腹腔注射20 mg/kg EGCG后的血浆动力学符合二室模型，消除半衰期较长，表观分布容积（Vd）大于总体水体积。[结论]该方法重现性好、分析时间短，能满足EGCG在大鼠血浆中浓度的检测要求，并符合《中国药典》2015年版对生物样品分析的要求，可用于大鼠血浆中EGCG的浓度测定和药代动力学研究。

关键词 高效液相色谱-质谱联用;EGCG;大鼠血浆;浓度;药代动力学

中图分类号 R 285  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）14-0172-04

Abstract [Objective] To establish a LC-MS/MS method to determine the concentration of EGCG in rat plasma and to study its pharmacokinetics.[Method]Choose Agilent SB-C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm），acetonitrile-water （90∶10） as mobile phase，isocratic elution，ESI ion source，multireactive ion monitoring，negative ion scanning.Vanillin was used as the internal standard，and the internal standard method was used for quantification.[Result] In this method，detection of EGCG and IS were not interfered by the matix，LOQ were 10 ng/mL （EGCG） and 5 ng/mL（vanillin） respectively，the intraassay and interassay precision （RSD） of plasma samples was ≤11.5%，the accuracy was 92.0%-118.9%，and the extraction recovery rate ≥92.7%，ME was 95.3%-115.3%.After injection of 20 mg/kg EGCG，the plasma dynamics of EGCG was in accordance with the two compartment model，the apparent volume of distribution （Vd） values of EGCG was larger than total body water volume.[Concusion]This method has good reproducibility and short analysis time，can meet the detection requirements of EGCG concentration in rat plasma，and meets the requirements for the analysis of biological samples in the 2015 edition of the Chinese Pharmacopoeia，which can be applied to the pharmacokinetic study of EGCG in rats.

Key words HPLC-MS/MS;EGCG;Rat plasma;Concentration;Pharmacokinetic

基金项目

国家自然科学基金项目（32060084）;云南省应用基础研究项目（2019FB119）;国家级大学生创新创业训练计划支持项目（202010676050）。

作者简介 乔妙（1997—），女，贵州毕节人，硕士研究生，研究方向：功能食品。*通信作者：袁文娟，副主任药师，博士，从事食品药品研究;王宣军，教授，博士，博士生导师，从事食品研究与开发工作。

收稿日期 2021-01-04

EGCG是绿茶中含量最高、活性较强的多羟基酚类化合物，占40%以上，属于儿茶素中的一类[1- 4]，具有抗氧化和自由基清除的功能，有助于治疗和清除某些类型的癌症、心血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病和肥胖[5-10]。因此，EGCG作为茶中重要的多酚类物质具有重要的研究价值。

目前，EGCG的研究是绿茶开发的热点和焦点[11-15]，但多集中在生物活性的研究上，国内外关于EGCG药动学的研究较少，且集中在茶多酚、给药途径为口服的研究上，检测方法多为HPLC-UV和HPLC-RID，这2种方法灵敏度低、专属性差，导致测定结果不准确[16]。云南农业大学普洱茶教育部重点实验室长期致力于EGCG的研究，此次试验建立一种简单、可靠、重现性好的检测方法，对其非临床药动学研究、毒动学研究具有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器。LC-30A液相色谱系统（配有四元梯度泵、在线脱气机，日本岛津公司）;API 5500型液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（配有电喷雾离子化源（ESI源），美国AB公司）;BS224S分析天平（德国Sartorius）;LX-500型旋涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）;ST-16R高速冷冻离心机（Thermo Fisher公司）;SK-18TC超声波发生器 （上海科导超声仪器有限公司）。

1.1.2 試药。EGCG（批号180705，含量>99.0%，HPLC法测定，含量按100%计，上海友思生物技术有限公司）;香草醛（AR，含量>99.0%，批次20191020，aladdin）;（+）-L-抗坏血酸（VC，含量99%，批次LC80Q50，北京百灵威科技有限公司）;乙二酸四乙胺二钠（EDTA-2Na，AR级，批次20191020，天津市大茂化学试剂厂）;乙酸乙酯（EtoAc，分析纯）;甲醇（CH3OH，分析纯）;乙腈（CH3CN，HPLC级，美国TEDIA公司）;水为纯净水;其余试剂均为分析纯。

1.1.3 动物。SPF级SD大鼠10只，雌雄各半，体重180～200 g，由成都达硕实验动物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（川）2015-030。饲养条件：室温（25±2） ℃，相对湿度为（50±10）%，每日交替12 h光照，自由饮水。

1.2 试验方法

1.2.1 大鼠药动学试验。大鼠10只，试验前12 h禁食，自由饮水，给药前用无菌生理盐水配制成适当浓度的EGCG溶液，腹腔注射，给药剂量20 mg/kg。于给药前及给药后5、10、20、45、90、120、180、360 min，从大鼠眼后静脉丛取血，置肝素化1.5 mL离心管中，低温离心，分离得血浆样品。于-80 ℃冻存，备用。

1.2.2 血液样品预处理。取大鼠血浆样品50 μL，精密加入0.2%VC-0.005%EDTA-2Na 10 μL、香草醛（5.0 μg/mL）10 μL，混匀，分别用乙酸乙酯200、100 μL漩混1 min，萃取2次，4 ℃低温离心5 min，合并乙酸乙酯层，45 ℃以下吹干，用10%乙腈水溶液200 μL，漩混1 min，低温离心5 min，取上清液进行LC-MS分析。

1.2.3 溶液的配制。

1.2.3.1 对照品储备液及工作液的配制。精密称取EGCG标准品适量，置100 mL容量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，得0.218 mg/mL的标准品储备液，取EGCG储备液，用甲醇梯度稀释，得到系列对照品工作液，EGCG浓度分别为109.000、87.200、4.360、2.180、0.872、0.218、0.109 μg/mL;储备液置于-20 ℃保存，工作液临用时现配，置于4 ℃冰箱保存。

1.2.3.2 内标香草醛（IS）溶液的配制。精密称取香草醛标准品适量，置100 mL容量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，得0.500 mg/mL的标准品储备液，再用甲醇稀释100倍得5.0 μg/mL内标溶液。

1.2.4 色谱条件与质谱条件。色谱柱为Agilent SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;柱温30 ℃;流动相为乙腈-水（90∶10）;流速0.5 mL/min;进样量1 μL;柱温为室温;离子源为ESI;负离子扫描，MRM监测;电喷雾电压-40 eV;用于定量分析的离子反应： m/z  457.3→168.9（EGCG）， m/z  150.9→135.6（内标香草醛），见图1。

1.2.5 方法学考察。

1.2.5.1 专属性考察。取大鼠空白血浆50 μL，用甲醇10 μL代替内标溶液，按“1.2.2”方法进行提取，按“1.2.4”色谱条件测定得空白血浆质谱图;另取空白血浆50 μL，精密加入EGCG对照品溶液（1.09 μg/mL）和内标溶液10 μL，按“1.2.2”方法进行提取，按“1.2.4”色谱条件测定得相应质谱图;另取腹腔注射后空白血浆50 μL，按“1.2.2”方法进行提取，按“1.2.4”色谱条件测定得相应质谱图。

1.2.5.2 标准曲线的绘制和定量限、检出限。精密量取50 μL大鼠空白血浆7份，分别加入109.000、87.200、4.360、2.180、0.872、0.218、0.109 μg/mL EGCG标准品溶液各10 μL，IS溶液（内标，5 μg/mL）10 μL，按“1.2.2”方法进行提取，按“1.2.4”色谱条件进行测定，以EGCG的浓度为横坐标 （x）、 EGCG与内标物的峰面积比值为纵坐标 （y）， 用加权最小二乘法（权重为1/ x2）进行回归运算，求得的直线方程即为标准曲线。以S/N>10、S/N>3 分别测得EGCG和内标（香草醛）的定量限和检出限。

1.2.5.3 精密度和准确度。分别取0.218、0.872、2.180、87.200 μg/mL的EGCG标准品溶液10 μL，加入空白血浆50 μL，按“1.2.2”方法进行提取，按“1.2.4”色谱条件进行测定，每个浓度6个平行样品，以标准曲线计算EGCG的浓度，并计算批内准确度和精密度;连续处理3个分析批，计算批间准确度和精密度。

1.2.5.4 稳定性试验。分别取0.218、87.200 μg/mL的EGCG标准溶液10 μL，加空白血浆50 μL，再加入空白基质提取液，涡旋混匀后检测，每一个浓度6个平行样本，分别考察冻融循环稳定性（-80 ℃和室温冻融循环3次）、室温短期6 h稳定性、长期30 d稳定性（-80 ℃长期存放）和样品制备后24 h自动进样器稳定性（5 ℃）。

1.2.6 稀释效应。制备21.8 μg/mL的血浆样本，用空白血浆稀释5倍后取10 μL，按“1.2.2”方法进行提取，按“1.2.4”色谱条件进行测定，平行测定6个样本。

1.2.7 残留。取空白血浆20 μL，按“1.2.2”方法进行提取，制备得到残留样本，在标准曲线最高点样本进样后进样残留样本。

1.2.8 回收率与基质效应。分别取低（0.218 μg/mL）、中（2.180 μg/mL）、高（87.200 μg/mL）的标准溶液10 μL，IS溶液（内标，5 μg/mL）10 μL，再加入空白基质提取液，涡旋混匀后检测，每一个浓度6个平行样本，峰面积记为Set1;分别取0.218、2.180、87.200 μg/mL的EGCG标准溶液，加入空白血浆50 μL，涡旋混匀后，按“1.2.2”方法进行提取，按“1.2.4”色谱条件进样分析，每一个浓度6个平行样本，峰面积记为Set2;回收率按Set2/Set1计算。

分别取低（0.218 μg/mL）、中（2.180 μg/mL）、高（87.200 μg/mL）的标准溶液10 μL，IS溶液（内标，5 μg/mL）10 μL，按“1.2.2”方法进行提取，按“1.2.4”色谱条件进样分析，每一个浓度6个平行样本，峰面积记为Set3;基质效应按Set1/Set3计算。

1.2.9 数据分析及药动学研究。给药数据采用对血药浓度（C）-时间（T）数据进行房室模型的判定及 t 1/2z、AUC、CL和Vd等药动学参数的计算。所有数据均表示为 ±S ，应用SPSS 11.5进行统计学分析，通过 t 检验进行显著性判定，如 P <0.05，则认为具有统计学显著性差异。

取-80 ℃存放的大鼠血浆样品，室温解冻，精密吸取50 μL 置1.5 mL离心管中，按“1.2.2”方法进行提取，按“1.2.4”色谱条件进样分析，根据标准曲线计算样本的浓度，大鼠腹腔注射EGCG后各时间点所测得的血药浓度-时间曲线，血药浓度和时间数据采用DAS 3.2（drug and statistics）计算药动学参数。

2  结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 专属性考察。由图2可见，EGCG和内标的保留时间分别为8.78、9.89 min，两者之间达到基线分离;空白血浆中杂质峰均在两者之前出现，不干扰EGCG和内标IS的含量测定，给药之后血浆样品的图谱中未见代谢物干扰，内源性物质不干扰EGCG和内标的测定。

2.1.2 标准曲线的建立和定量限、检出限。 按照“1.2.5.2”方法操作，以EGCG的濃度为横坐标（ x ）、EGCG与内标物的峰面积比值为纵坐标（ y），用加权最小二乘法（权重为1/x2）进行回归运算，求得的回归方程为y=4 094.174 83x+11 313.197 16（r =0.993 4），表明EGCG在5.45～5 450.00 ng/mL 线性关系良好。以 S/N >10测得EGCG和内标（香草醛）的定量限分别为10和5 ng/mL，以 S/N >3测得EGCG和香草醛的检出限均为1 ng/mL。

2.1.3 精密度和准确度。按照“1.2.5.3”方法操作，结果发现（表1），批内和批间准确度在92.0%～118.9%，RSD≤11.5%，符合《中国药典》2015年版对生物样本的检测要求。

2.1.4 稳定性试验。按照“1.2.5.4”方法操作，结果发现（表2），RSD≤10.7%，符合药典测定要求，表明供试品在-80 ℃和室温冻融循环3次、室温6 h、-80 ℃存放30 d、自动进样器24 h（5 ℃）基本稳定。

2.2 稀释效应 按照“1.2.6”方法操作，平行测定6个样本，结果发现准确度均值为87.5%，精密度（RSD）为5.8%，说明高浓度血浆样本经过5倍稀释不影响待测物的准确定量。

2.3 残留 在标准曲线最高点样本进样后进样残留样本，结果表明残留样本峰面积小于定量下限峰面积的20%，符合要求。

2.4 回收率与基质效应 从表3可以看出，EGCG的萃取回收率在92.7%～114.5%;基质效应在95.3%～115.3%。结果表明，EGCG在各浓度下提取回收率一致，基质因子符合要求。该方法准确度高、重现性好。

2.5 数据分析与药动学结果 大鼠腹腔注射EGCG后各时间点所测得的血药浓度-时间曲线见图3，血药浓度和时间数据采用DAS 3.2计算药动学参数，主要药动学结果见表4，大鼠腹腔注射EGCG（20 mg/kg）后的血浆动力学符合二室模型，消除半衰期较长，表观分布容积（Vd）大于总体水体积。

3 讨论与结论

该研究分别考察了不同的流动相和色谱柱，优选了分析条件，此色谱条件下EGCG和内标（香草醛）峰形较好，出峰时间适中，内源性物质不干扰分析物，且可以准确定量;血浆样本处理采用了液液萃取的方法，方法简便易行，能达到较高的响应且不具有基质效应，能满足高通量分析要求。血浆样本用量少，且灵敏度高;按常规方法对方法学的专属性进行考察，采用质控样品对精密度、准确度、样品存放稳定性等进行方法学验证，均符合《中国药典》2015年版对生物样品分析的要求。

该研究建立了LC-MS/MS测定大鼠血浆中EGCG的分析方法，该方法快速、灵敏、准确，符合生物样品分析方法的指导原则的要求，并成功地应用到腹腔注射给药后在大鼠体内的药动学研究，获得了药动学的参数。结果表明，EGCG在大鼠体内的药物变化趋势符合腹腔注射药动学的特点，具有分布迅速、给药频次低的特点。该研究结果为进一步研究EGCG药动-药效学性质提供了参考依据和技术保障。

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