咖啡因缓释片在健康人体内的药动学研究

赵娜萍，周 佳，谭 军，邓 敏，张 黎，王 卓*

(1.海军军医大学长海医院药学部，上海 200433；2.上海交通大学医学院附属新华医院药学部，上海 200092)

咖啡因是一种中枢兴奋药，具有提高多巴胺受体的敏感性、阻断腺苷受体和苯二氮受体等多种药理学作用[1]，常被添加至饮料和食品中，许多药品中含有咖啡因，大约有60多种天然植物中也有咖啡因成分[2]。药效学研究证明，低、中摄入量的咖啡因对大脑有很多积极作用，包括兴奋大脑、振奋精神、提高注意力、改善情绪等[3]。在高强度、高要求、高度紧张的作业环境下，咖啡因制剂可以提升人员的认知作业和体力作业效率，并且可以在缺乏睡眠的情况下有效保持机体警觉.因其对中枢神经系统和骨骼肌具有兴奋作用，甚至在某些高强度极端环境下能提升人员的快速反应力，有效提高工作效率[4]，因此具有较大的应用前景。本研究的健康受试者服用咖啡因缓释片，一天两次口服给药，减少用药次数，提高用药依从性，建立了简单、快速、准确的HPLC法测定血浆中的咖啡因浓度，计算药动学参数，考察了咖啡因缓释片的药动学特性。

1 材料和方法

1.1 仪器和试药 (1)仪器：LC-2010A型高效液相系统，包括ACE 5 C18-AR色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)由日本岛津公司提供；5804R高速冷冻离心机和移液器(10～100 μl、20～200 μl、100～1000 μl)由Eppendorf公司提供；AG285十万分之一电子分析天平(Mettler Toledo公司)。(2)试剂和药品：受试制剂咖啡因缓释片(规格300 mg/片，某大学自行研发，批号0807448)；参比制剂安钠咖片(规格150 mg/片，四川锡成药业有限公司，批号090401)；甲醇(色谱纯，Tedia公司)；咖啡因对照品(纯度99.8%，批号100807)和二羟丙茶碱(纯度99.5%，批号0902272)由某大学提供。空白人血浆来自健康受试者。

1.2 受试者选择 入选标准：(1)年龄18～40岁，男性；(2)体重指数(BMI)为19～24 kg/m2；(3)实验室检查，包括血常规、尿常规、血液生化检查、心电图检查、胸片检查等，结果正常或异常无临床意义；(4)无心、肝、肾、消化道和血液系统等疾病史；(5)不吸烟，不嗜酒。排除标准：(1)健康检查不符合入选标准；(2)有中枢神经系统、呼吸系统、代谢系统的明确病史或其他显著疾病；(3)有明确的药物过敏史或体位性低血压史；(4)筛选前3个月内参加过其他临床药物试验或有献血史；(5)筛选前2周内服用过可能影响本试验结果的药物；(6)滥用毒品者。本试验方案经海军军医大学长海医院伦理委员会批准，所有受试者均签署书面知情同意书，按GCP要求实施试验方案。共入组10例男性健康受试者，年龄21～27岁，平均年龄22岁，BMI 19.71～23.67 kg/m2，平均BMI为21.97 kg/m2。

1.3 试验设计 采用两制剂双周期交叉试验设计，两个试验周期之间的清洗期为1周。将10例男性健康受试者按体重从轻到重依次编号，若体重相同，则再按身高由低到高依次编号，然后采用随机数字表法，随机分为两组，每组5例。受试者于给药前1 d入选，在给药前进行生命体征、体格、实验室、心电图和胸片检查。首次给药前一天晚餐后开始禁食(禁食至少10 h)，给药当日早晨7：00空腹，用200 ml温开水送服规定剂量的试验药物。试验组在第1个周期口服受试制剂(咖啡因缓释片，300 mg)，对照组在第1个周期口服参比制剂(安钠咖片，150 mg)，服药后2 h可饮水，4 h后进食统一低脂膳食。首次给药后第4天早晨7：00空腹再次给药，2 h后进餐。之后，试验组每12 h用药一次，300 mg/次；对照组每6 h用药一次，150 mg/次，连续给药4 d。第7天咖啡因缓释片仅早晨给药一次，安钠咖片给药两次。间隔1周的清洗期后再交叉给药。受试者在第1、2个周期首次服药当天和第7天在Ⅰ期病房至少留观12 h，由Ⅰ期病房的医师和护士观察受试者的心率、血压及皮疹、恶心、呕吐、腹痛、腹泻、眩晕、头痛等药品不良反应(ADRs)发生情况。整个试验期间受试者禁止饮用含柑橘、柠檬、葡萄、柚子、咖啡因、酒精或黄嘌呤的饮料，禁止剧烈运动及白天长时间躺卧。试验结束时再次进行生命体征、体格、实验室和心电图检查。

1.4 血样采集 对照组在第1次给药前及给药后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、14、24 h，第11～14次给药前及第14次给药后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6 h，第15次给药后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、14、24 h，分别于肘静脉采血1.5 ml。试验组在第1次给药前及给药后0.5、1、2、3、4、6、8、10、15、24、36、48 h，第5～8次给药前及第8次给药后0.5、1、2、3、4、6、8、10、15、24、36、48 h，分别于肘静脉采血1.5 ml。肝素抗凝，置一次性塑料离心管中，以相对离心力1.5×104×g离心10 min，分取血浆置-20 ℃冰箱保存备用。

1.5 咖啡因血浆浓度的测定 (1)溶液的配制：①精密称取咖啡因对照品0.025 0 g，置25 ml棕色量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得浓度为1 mg/ml的咖啡因对照品储备液，将该储备液置4 ℃冰箱保存备用。②精密称取二羟丙茶碱对照品0.025 0 g，置50 ml棕色量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得浓度为500 μg/ml的二羟丙茶碱(内标)储备液，置4 ℃冰箱保存备用。取适量内标储备液用50%甲醇水溶液稀释，配置成0.5 μg/ml的内标工作液。③取适量咖啡因对照品储备液，用50%甲醇水溶液稀释，配置成系列浓度为2、10、20、33.333、50、80、100 μg/ml的咖啡因标准曲线工作液。另外配置10、33.3、80 μg/ml的质控工作液。(2)血浆样品预处理：吸取血浆样品0.3 ml，置1.5 ml离心管中，加浓度0.5 μg/ml的内标溶液30 μl，涡旋混匀10 s，加入10%三氯乙酸水溶液120 μl，涡旋混匀3 min，以相对离心力4.5×103×g离心10 min，取上清液10 μl进样分析。(3)HPLC法测定：用HPLC法测定人血浆中咖啡因的浓度，选择ACE 5 C18-AR色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：甲醇-0.2%乙酸溶液(17∶83)，流速1.0 ml/min；检测波长274 nm；进样体积10 μl；每个样品的分析时间17 min。

1.6 方法学考察

1.6.1 专属性试验 测定空白血浆、空白血浆+咖啡因对照品+内标(咖啡因浓度2000 ng/ml)，以及用药后血浆样品+内标的色谱图(见图1)。由图1可见，咖啡因和内标的保留时间分别为 9.0和15.6 min，两者分离度>1.5，空白血浆中内源性物质不干扰咖啡因和内标的测定。

图1 咖啡因的HPLC谱图

1.6.2 标准曲线的制备 取0.27 ml空白血浆，加入30 μl不同浓度的咖啡因标准曲线工作液和30 μl内标溶液，使血浆中咖啡因浓度分别为200、1000、2000、3333.3、5000、8000、10 000 ng/ml。按1.5项下血浆样品预处理方法处理后，进样分析。以咖啡因峰面积与内标峰面积的比值(y)为纵坐标，以质量浓度(x)为横坐标，做加权直线回归计算。得到线性回归方程为：y=0.000 3x-0.002 2(r=0.999 9)，线性范围为200～10 000 ng/ml。血浆中咖啡因定量下限为200 ng/ml(S/N>10)。

1.6.3 精密度试验和准确度试验 取0.27 ml空白血浆，加入30 μl内标溶液和30 μl不同浓度的咖啡因标准曲线工作液，制备咖啡因浓度为1 000、3 333.3、8 000 ng/ml的含药血浆，按1.5项下血浆样品预处理方法处理。取3个批次的血浆样品，每种浓度平行制备5份，连续3 d，用HPLC法测定浓度，计算日内、日间RSD和准确度，结果见表1。

表1 咖啡因血浆浓度测定的精密度和准确度试验结果

1.6.4 回收率试验 取0.27 ml空白血浆，加入30 μl不同浓度的咖啡因质控工作液及30 μl内标溶液，制备咖啡因浓度为1 000、3 333.3、8 000 ng/ml的含药血浆，按1.5项下血浆样品预处理方法处理，进样测定。将空白血浆换成去离子水，同法操作，测定浓度，作为对照。最终得到低、中、高浓度咖啡因的提取回收率分别为(99.34±2.21)%、(103.56±4.78)%、(106.52±5.31)%(n=5)，符合生物样品分析要求。

1.6.5 稳定性试验 配置低、中、高3种不同浓度的质控样品，按以下条件分别处理。(1)将质控样品按1.5项下血浆样品预处理方法处理后，在自动进样器中室温放置24 h，进样测定；(2)将质控样品在室温与-20 ℃冰箱放置两种条件之间反复冻融3个循环，第3次冻融后，按照血浆样品预处理方法处理，进样测定；(3)将质控样品在-20 ℃冰箱中放置30 d后，分别按照血浆样品预处理方法处理，进样测定。结果见表 2。结果表明，含药血浆溶液在上述条件下放置均能够保持稳定。

表2 血浆中咖啡因的稳定性试验结果

2 结 果

2.1 单次给药的药动学参数 10例健康受试者分别单次口服150 mg安钠咖片或300 mg咖啡因缓释片后，经DAS 2.1.1软件处理，分别计算出相应的药动学参数。结果见表3。

表3 单次口服安钠咖片和咖啡因缓释片后的药动学参数

2.2 多次给药的药动学参数 10例健康受试者分别多次口服安钠咖片或咖啡因缓释片的药-时曲线见图2。经DAS 2.1.1软件处理，分别计算出咖啡因的药动学参数，结果见表4。

图2 多次口服安钠咖片和咖啡因缓释片后的咖啡因药-时曲线

表4 多次口服安钠咖片和咖啡因缓释片后的药动学参数

2.3 药动学参数的比较 从药动学参数上可以看出，与安钠咖片相比，咖啡因缓释片单次给药和多次给药的cmax稍有区别，但无统计学差异；tmax延长，多次给药的波动系数(DF)减小(P<0.05)，表明咖啡因缓释片具有明显缓释特性。多次口服安钠咖片和咖啡因缓释片的AUC0-t显著高于单次口服给药[(146.55±54.44) mg·h·L-1vs(29.69±8.34) mg·h·L-1,(172.28±83.63) mg·h·L-1vs(72.42±42.38) mg·h·L-1，P<0.05]，提示多次连续给药后，咖啡因在体内有一定的蓄积。

3 讨 论

目前文献报道的咖啡因含量测定方法中，也有使用HPLC-MS法，虽然灵敏度较高，但线性关系稍差，单次检测存在偏差，并且检测成本较高[5]。因此，本文建立了HPLC法测定咖啡因的血浆浓度，参考以往研究采用了蛋白沉淀法对血浆样品做预处理[6]，从血浆中分离咖啡因，操作简单；内标采用咖啡因类似物二羟丙茶碱[7]，保留时间适当，分离度好，因此本研究采用的HPLC法能满足测定需要，简便、易操作、经济、快速。

在临床应用中，与普通片剂相比，缓释制剂可较长时间保持有效血药浓度，减少血药浓度的波动，达到有效、长效、稳定、安全用药的目的，同时也能减少血药浓度波动带来的ADRs。在本次临床试验过程中，10例健康受试者均未发生明显的ADRs。

咖啡因是临床最常用的中枢神经兴奋剂[2]，能促进神经系统激活，并加强骨骼肌收缩，从而有助于机体快速反应。研究表明，在高度压力和睡眠不足的情况下，服用较高剂量的咖啡因可以使受试者保持认知功能，增强大脑警惕性和逻辑性，提高工作效率[7]。这可能与咖啡因是腺苷受体拮抗剂有关，咖啡因结合腺苷受体，主要作用于A1和A2A受体[2，7]，而这些受体又与睡眠相关的大脑功能有关[8]。基于咖啡因的药理学特征及其与睡眠的关系，咖啡因在临床和某些特殊要求的作业环境下具有良好的应用前景。本研究所用的咖啡因缓释片每日仅需服药两次，而普通片剂需要每日服药4次，缓释片减少了服药次数，有助于提高用药依从性，更方便、安全，且作用持久。本研究对于咖啡因缓释制剂的研发具有重要指导意义。