复方参芪片的质量标准研究

崔晓博，李明春，刘 旭，程艳芹

(海军第九七一医院药剂科，山东青岛 266071)

复方参芪片为海军第九七一医院的自制制剂[批准文号：总制字(2016)F405002]，由补骨脂(君药，具有补肾壮阳、固精缩尿、温脾止泻、纳气平喘等功效)、黄芪(君药，具有益卫固表、利尿消肿、托毒生肌等功效)、丹参、降香等十五味药材制成，具有疏风祛湿、通络达表、滋补肝肾的功效，主治白癜风。该制剂经临床使用多年，疗效确切。为了更好地控制该制剂的质量，保证其临床用药的安全性和有效性，本研究对原质量标准中的薄层鉴别法进行修订和增补，并增加了制剂中主要成分补骨脂的含量测定项。

1 仪器和试药

1.1 仪器 JM-B2102型百分之一电子天平(余姚市纪铭称重校验设备有限公司)；FA1604型万分之一电子分析天平(上海衡平仪表厂)；DV215CD型十万分之一电子天平(美国OHAUS公司)；SY2200-T型超声波清洗器(上海声源超声仪器设备有限公司)；Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；WD-9340C型紫外分析仪(北京六一仪器厂)；电热恒温水浴锅(上海梅香仪器有限公司)。

1.2 试药 以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂分厂)；补骨脂素(批号110739-201115，含量为99.9%)、异补骨脂素(批号110738-201313，含量为100%)、黄芪甲苷(批号110781-201314，含量为96.9%)、柴胡皂苷对照品(批号110778-201310，含量为97.3%)，补骨脂(批号121056-200904)、丹参(批号120923-201414)、柴胡(批号120992-201108)、黄芪(批号121462-201304)、当归(批号120927-201516)对照药材均购于中国食品药品检定研究院；乙腈及甲醇均为一级色谱纯(天津市四友生物医学技术有限公司)；复方参芪片样品(批号20140421、20140910、20150317)、阴性样品及蒸馏水均为海军第九七一医院自制；其他试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 补骨脂的薄层鉴别[1-2]取复方参芪片，研细，称取粉末10 g，加入甲醇40 ml，超声20 min后过滤，滤液蒸干，残渣加水20 ml溶解，用乙酸乙酯30 ml分两次振摇提取，蒸干，残渣加甲醇1 ml溶解，作为供试品溶液。取缺补骨脂的复方参芪片阴性样品10 g，同法制成阴性对照溶液。取补骨脂对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。取补骨脂素和异补骨脂素对照品，加入甲醇，制成浓度各为1 mg/ml的对照品溶液。吸取上述供试品溶液5 μl、对照药材溶液7 μl、对照品溶液3 μl、阴性对照溶液5 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点(上层黄绿色斑点为异补骨脂素，下层淡黄色斑点为补骨脂素)，而阴性对照溶液在相应位置上显示蓝色斑点，无干扰。见图1。

图1 补骨脂的薄层色谱图

2.1.2 丹参的薄层鉴别[2-3]取复方参芪片，研细，称取粉末2 g，加水10 ml溶解，以相对离心力8.05×g离心5 min，取上清液，加稀盐酸调pH至2，加乙酸乙酯20 ml，振摇提取，提取液置水浴蒸干，残渣加甲醇1 ml溶解，作为供试品溶液。取缺丹参的复方参芪片阴性对照样品2 g，同法制成阴性对照溶液。取丹参对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液各5 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-丙酮-甲酸(25∶10∶4)为展开剂，展开，取出，晾干后，置氨蒸汽中熏后，在空气中放置10 min，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显黄绿色斑点，而缺丹参的复方参芪片阴性对照溶液在相应位置上显蓝色斑点，无干扰。见图2。

图2 丹参的薄层色谱图

2.1.3 柴胡的薄层鉴别[2，4]取复方参芪片，研细，称取粉末10 g，加甲醇30 ml，超声处理30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加水20 ml使溶解，加水饱和的正丁醇提取2 次(30 ml/次)，合并正丁醇液，加氨试液(40 ml浓氨水加水稀释到100 ml)40 ml洗涤，弃去氨试液，蒸干正丁醇，残渣加甲醇1 ml溶解，作为供试品溶液。取缺柴胡的复方参芪片阴性对照样品10 g，同法制成阴性对照溶液。取柴胡对照药材1 g，加水50 ml，煮沸30 min，放冷，过滤，滤液加水饱和正丁醇振摇提取2次，同法制成对照药材溶液。取柴胡皂苷对照品，加甲醇，制成浓度为1 mg/ml的对照品溶液。吸取复方参芪片供试品溶液5 μl、对照药材溶液5 μl、对照品溶液5 μl、阴性对照溶液5 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-稀氨水(1→10，即将浓氨水体积稀释10倍)(4∶1∶5)的上层溶液为展开剂[4]，展开，取出，晾干，喷以2%对二甲氨基苯甲醛的硫酸乙醇溶液(1→10)，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，均显相同的粉红色斑点，同时阴性对照溶液无干扰。见图3。

图3 柴胡的薄层色谱图

2.1.4 黄芪的薄层鉴别[5-6]取复方参芪片，研细，称取粉末10 g，加水饱和正丁醇60 ml，加热回流1 h，滤过，滤液用1% NaOH溶液洗涤3次，每次15 ml，弃去NaOH溶液，用水饱和的正丁醇洗至中性，弃去水液，置水浴蒸干正丁醇，残渣用甲醇1 ml溶解，作为供试品溶液。取缺黄芪的复方参芪片阴性对照样品10 g，同法制成阴性对照溶液。另取黄芪对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成浓度为1 mg/ml的对照品溶液。吸取上述4种溶液各3 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-水(65∶35∶10)的下层溶液为展开剂[5]，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同的棕色斑点，阴性对照无干扰。见图4。

图4 黄芪的薄层色谱图

2.1.5 当归的薄层鉴别[2]取复方参芪片，研细，称取粉末10 g，加乙酸乙酯40 ml，超声30 min，过滤，滤液蒸干，加乙醇1 ml溶解，作为供试品溶液。取缺当归的复方参芪片阴性对照样品10 g，同法制成阴性对照溶液。另取当归对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液各5 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的白色斑点，阴性对照无干扰。见图5。

图5 当归的薄层色谱图

2.2 补骨脂素和异补骨脂素的含量测定

2.2.1 色谱 条 件

Agilent XDB-C18 色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(34∶66)，流速1.0 ml/min，检测波长246 nm，柱温25 ℃；进样量为10 μl。理论塔板数按补骨脂素峰计算均≥3000。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取补骨脂素对照品11.32 mg和异补骨脂素对照品10.04 mg，分别置于100 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，分别作为对照品储备液1(补骨脂素浓度为113.1 μg/ml )和对照品储备液2(异补骨脂素浓度为100.4 μg/ml)。精密量取两种对照品储备液各10 ml，用甲醇定容至50 ml容量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液(补骨脂素和异补骨脂素浓度分别为22.62和20.08 μg/ml)。

2.2.3 供试品溶液的制备 取复方参芪片样品适量，研细，精密称定0.2 g，置于具塞玻璃锥形瓶中，精密加入20 ml甲醇，称定重量，超声处理30 min，放冷，再次称定重量，用甲醇补足缺失重量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 取缺补骨脂的阴性样品粉末，按照2.2.3项下方法制备缺补骨脂的阴性对照溶液。

2.2.5 专属性试验 吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μl，分别按2.2.1项下色谱条件测定，记录色谱峰。结果样品中补骨脂素、异补骨脂素峰与其他组分色谱峰分离良好，阴性对照对检测无干扰。见图6。

图6 复方参芪片的HPLC谱图

2.2.6 线性关系考察 精密吸取对照品储备液1(补骨脂素浓度为113.1 μg/ml)和对照品储备液2(异补骨脂素浓度为100.4 μg/ml)2.5、5.0、10.0、12.5、17.5、20.0、25.0 ml，分别用甲醇定容至50 ml容量瓶中，得浓度为5.65、11.31、22.62、28.27、39.58、45.23、56.54 μg/ml的系列补骨脂素对照品溶液和浓度为5.02、10.04、20.08、25.10、35.14、40.16、50.20 μg/ml的系列异补骨脂素对照品溶液。将上述不同浓度的补骨脂素对照品溶液和异补骨脂素对照品溶液分别注入色谱仪，进样量为10 μl，记录色谱峰。以峰面积(Y)为纵坐标，进样浓度(X)为横坐标，分别绘制标准曲线，得补骨脂素回归方程为：Y=65.51X-6.817(r=0.999 9，n=7)。结果表明，补骨脂素在5.65～56.54 μg/ml范围内有良好的线性关系。异补骨脂素回归方程为：Y=70.27X+11.33(r=0.999 9，n=7)。结果表明，异补骨脂在5.02～50.20 μg/ml范围内有良好的线性关系。

2.2.7 精密度试验 取补骨脂素和异补骨脂素浓度分别为22.62和20.08 μg/ml的对照品溶液，精密吸取10 μl，注入色谱仪，重复进样6次，测定其峰面积。结果补骨脂素峰面积的RSD=0.8%(n=6)，异补骨脂素峰面积的RSD=0.9%(n=6)，表明仪器精密度良好。取复方参芪片(批号20140421)供试品溶液，精密吸取10 μl，注入色谱仪，重复进样6次，测定其峰面积，结果补骨脂素峰面积的RSD=0.8%(n=6)，异补骨脂素峰面积的RSD=0.8%(n=6)，表明该方法精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取复方参芪片(批号20140421)供试品溶液，分别于0、2、4、8、10、12 h各进样1次，每次10 μl，测定其峰面积，结果补骨脂素峰面积的RSD=0.8%(n=6)，异补骨脂素峰面积的RSD=0.8%(n=6)，表明复方参芪片供试品溶液至少在12 h内稳定。

2.2.9 加样回收率试验 取补骨脂素和异补骨脂素浓度分别为22.62和20.08 μg/ml的对照品溶液备用，取复方参芪片(批号20140421)适量，研细，精密称取9份粉末，每份0.100 g，按2.2.3项下方法制成供试品溶液，分别按照供试品中含补骨脂素和异补骨脂素量的0.8倍、1倍、1.2倍加入对照品溶液，各平行做3份，并按2.2.1项色谱条件测定，根据测得量和加入量，计算各待测成分的加样回收率。结果补骨脂素和异补骨脂素的平均加样回收率分别为(99.80±1.8)%和(100.8±2.5)%(n=9)。

2.2.10 含量测定结果 分别取3个批次的复方参芪片适量，研细，每批次取粉末3份，每份0.2 g，按照2.2.3项下方法制备供试品溶液，测定含量，结果批号为20140421、20140910、20150317的复方参芪片中，补骨脂素的含量分别为(1.94±0.025)、(1.45±0.032)、(1.47±0.016) mg/g，异补骨脂素的含量分别为(1.65±0.020)、(1.35±0.022)、(1.38±0.015) mg/g(n=3)。

3 讨 论

3.1 薄层鉴别的改进 本研究改进了原质量标准中补骨脂和丹参的鉴别方法，将补骨脂的鉴别方法改为TLC法，使得方法简单易操作，并通过多次实验，调整展开剂的比例，使薄层色谱显色清晰。在丹参的薄层鉴别中，用二氯甲烷替代三氯甲烷作为展开剂，使得试剂的毒性降低。增加了原标准中没有的柴胡、黄芪、当归的薄层鉴别项，分别通过反复多次实验调整展开剂的组成及比例，使得新增加的鉴别项专属性强，所用试剂毒性小、配制简单，且鉴别方法简便易操作。

3.2 HPLC法吸收波长和流动相的选择 根据参考文献[2，7-9]，选择246 nm为最佳吸收波长。预实验尝试了不同的流动相，如甲醇-水(45∶55、50∶50、55∶45、52∶48、47∶53)、乙腈-水(47∶53)，使用这些流动相时，待测成分与杂质峰均有干扰。当流动相为乙腈-水(34∶66)时，未有杂质峰干扰且出峰时间较短。

3.3 HPLC法提取溶剂用量的选择 在供试品溶液的制备中，本研究分别考察了选用10、20、30 ml的甲醇作为提取溶剂量，并对所得结果使用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，结果提取溶剂为10 ml 组与20 ml组的数据之间存在显著性差异(P<0.05)，20 ml 组与30 ml组之间不存在显著性差异(P>0.05)，为保证提取效果且节约溶剂用量，故选择20 ml作为提取溶剂的用量。

3.4 HPLC法提取时间的选择 在供试品溶液的制备时，本研究同时考察了3种不同提取时间的效果，分别为超声处理(功率500 W，频率40 kHz)20、30、40 min，同样对3组结果使用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，结果提取20 min组与提取30 min组的数据之间存在显著性差异(P<0.05)，提取30 min组与提取40 min组之间无统计学差异(P>0.05)，为节约实验时间，故选择30 min作为提取时间。

本研究确立了复方参芪片中补骨脂素和异补骨脂素的含量测定方法，本方法简便、有效、易操作，能够有效地控制复方参芪片的质量，使本制剂的质量标准得到完善，并进一步保障了临床的用药安全性。